310 10*1mm Ruostumattomasta teräksestä valmistettu kierreputki kemiallinen komponentti, Spidroiinin N-pään domeenit muodostavat amyloidifibrilleihin perustuvia hydrogeelejä ja tarjoavat alustan proteiinien immobilisaatiolle.

Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käytät selainversiota, jossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Liukusäätimet, joissa näkyy kolme artikkelia per dia.Käytä Takaisin- ja Seuraava-painikkeita liikkuaksesi diojen välillä tai diaohjaimen painikkeita lopussa.

Erittely

310 10*1mm ruostumattomasta teräksestä valmistettujen kierreputkien toimittajat

Kemiallinen koostumus

Mekaaniset ominaisuudet

Rekombinanttisilla hämähäkkisilkkiproteiineilla (hämähäkkisilkkiproteiineilla) on monia potentiaalisia sovelluksia uusien biomateriaalien kehittämisessä, mutta niiden multimodaalinen ja aggregaatioaltis luonne tekee niistä vaikeasti saatavia ja helppokäyttöisiä.Tässä raportoimme, että rekombinantit miniatyyri spidroiiniproteiinit ja mikä tärkeintä, itse N-terminaalinen domeeni (NT) muodostavat nopeasti itsekantavia ja läpinäkyviä hydrogeelejä 37 °C:ssa.NT:stä ja vihreästä fluoresoivasta proteiinista tai puriininukleosidifosforylaasista koostuvat fuusioproteiinit muodostavat täysin toimivia fuusioproteiineja.Hydrogeelit.Tuloksemme osoittavat, että rekombinantti-NT- ja fuusioproteiinit tarjoavat korkeat ilmentymissaadot ja antavat hydrogeeleille houkuttelevia ominaisuuksia, kuten läpinäkyvyyden, geeliytymisen ilman silloitusta ja aktiivisten proteiinien suoran immobilisoinnin suurella tiheydellä.
Hämähäkeissä on jopa seitsemän erilaista silkkirauhasta, joista jokainen tuottaa tietyntyyppistä silkkiä.Kaikki seitsemän silkkilajia koostuvat hämähäkin silkkiproteiineista (spidroiinit), jotka ovat noin 6000 tähdettä pitkiä ja sisältävät suuren keskeisen toistoalueen, jota ympäröivät pallomaiset N- ja C-terminaaliset domeenit (NT ja CT)1,2.Kaikkein laajimmin tutkittu silkkityyppi, primaarinen ampulla, tuotetaan primaarisella ampullarauhasella.Tässä rauhasessa epiteelisolujen yksikerros syntetisoi spidroiiniproteiineja ja erittää niitä rauhasen onteloon, jossa niitä on liukoisessa muodossa (doping) erittäin korkeina pitoisuuksina (30–50 % w/v)3,4.Tärkeimpien ampullaaristen spidroiiniproteiinien organisoinnista ja konformaatiosta rauhasessa on keskusteltu, mutta useimmat kokeelliset todisteet osoittavat yleisesti kierteisen ja/tai satunnaisen kierteisen konformaation ja miselli- tai lamellaaristen rakenteiden läsnäolon5,6,7,8,9,10.Vaikka toistuvat domeenit säätelevät silkkikuitujen mekaanisia ominaisuuksia muodostaen β-levyn nanokiteitä ja amorfisia rakenteita 11, 12, 13, 14, 15, päätealueet säätelevät silkkikuituja vasteena muuttuviin olosuhteisiin silkkirauhasen varrella16, 17, 18.Hallitsemalla silkin muodostumista 19. Terminaaliset domeenit ovat evoluutionaalisesti konservoituneita ja niiden toiminta voi olla yhteinen kaikille spidroiiniproteiineille 2,20,21.Kulkiessaan rauhasen läpi spidroiinin pH laskee noin 7,6:sta < 5,716:een ja kasvaa vähitellen kapenevan kanavan läpi tapahtuvan liikkeen välittämän leikkauksen ja venytyksen myötä.Liuoksessa CT on α-kierteinen konstitutiivinen rinnakkaisdimeeri17, mutta vasteena alhaisille pH- ja leikkausvoimille CT avautuu ja vaihtaa β-kerroksia16, 17, mikä mahdollisesti laukaisee β-kerroksia Convert 16:n toistuvilla alueilla. NT:t ovat monomeerisiä. olosuhteet, jotka kuvastavat rauhasen ontelon olosuhteita ja välittävät spidroiinin liukoisuutta, mutta alennetussa pH:ssa useiden karboksyylihapposivuketjujen protonoituminen johtaa NT:n dimeroitumiseen pKa:lla noin 6,5, mikä stabiloi NT:tä ja kiinnittää spidroiinin suuriin määriä.verkot16,18.Siten NT:llä on avainrooli filamentin muodostuksessa muuttuen päällysteen monomeerista kuidun dimeeriksi23,24,25.NT pysyy erittäin liukoisena ja kierteisenä kaikissa tähän mennessä tutkituissa olosuhteissa16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, mikä inspiroi sen kehittämistä liukoisuutta lisäävänä leimana heterologisten proteiinien tuotantoon.
Rekombinantti minihämähäkin silkkiproteiini, joka koostuu yhdestä NT:stä, yhdestä lyhyestä toistoalueesta, yhdestä CT:stä ja His6-tagista (His-NT2RepCT) puhdistusta varten, on yhtä liukoinen vesipitoiseen puskuriin kuin natiivi hämähäkin silkkiproteiini ja jäljittelee silkkihämähäkin luontaisia ​​tärkeitä ominaisuuksia. .kattavuus 25.31.His-NT2RepCT voidaan kehrätä jatkuviksi kuiduiksi käyttämällä biomimeettistä konetta, jossa pH 8:n liukoinen pinnoite ekstrudoidaan pH 525, 32, 33, 34, 35 vesihauteeseen.His-NT2RepCT:tä ilmentävän E. colin bioreaktorifermentointi ja sitä seuraava jälkikäsittely johtivat >14 g/l saantoon puhdistuksen jälkeen.His-NT2RepCT:n korkea saanto, korkea liukoisuus ja riittävä vaste happamiin olosuhteisiin johtuvat kaikki NT23:sta, 25:stä, 34:stä.
Tässä raportoimme läpinäkyvien hydrogeelien nopeasta muodostumisesta rekombinanteista spidroiiniproteiineista, mukaan lukien pelkkä NT, inkuboimalla proteiiniliuosta 37 °C:ssa.Käyttämällä tioflaviini T -fluoresenssia (ThT), Fourier-muunnosinfrapunaspektroskopiaa (FTIR), ydinmagneettista resonanssispektroskopiaa (NMR) ja transmissioelektronimikroskooppia (TEM) havaitsimme, että NT- ja mikrohämähäkkiproteiinit muuttuvat rakenteellisesti β-levyiksi ja amyloidin kaltaisiksi fibrilleiksi. kun geelit muodostuvat.Lisäksi NT:n ja vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) tai puriininukleosidifosforylaasin (PNP) fuusioproteiinit muodostavat hydrogeelejä, joissa on täysin toimivia fuusiofragmentteja.Korkean suorituskyvyn ilmentyminen heterologisissa isännissä yhdistettynä nopeaan hydrogeelien muodostumiseen fysiologisissa olosuhteissa avaa mahdollisuuden kustannustehokkaaseen hydrogeelien tuotantoon, joilla on teknisiä toimintoja.
Toisin kuin useimmat raportoidut rekombinantit spidroiiniproteiinit36, His-NT2RepCT on stabiili Tris-HCl-puskurissa pH:ssa 8 ja se voidaan konsentroida 500 mg/ml asti ilman saostumista25.Siksi olimme yllättyneitä havaitessamme, että tämä proteiini muodostaa nopeasti optisesti kirkkaita, itsestään kantavia hydrogeelejä, kun sitä inkuboidaan 37 °C:ssa (kuvio 1b-d).Lisätutkimukset osoittivat, että His-NT2RepCT-geeliytyminen tapahtui laajalla proteiinipitoisuuksien alueella (10-300 mg/ml) ja että tämä pitoisuus korreloi käänteisesti geeliytymisajan kanssa (kuva 1c ja täydentävä kuva 1).Selvittääksemme, mitkä His-NT2RepCT:n osat välittävät hydrogeelin muodostumista, tutkimme sitten kutakin domeenia erikseen ja eri yhdistelminä käyttäen pullon inversiomääritystä (kuvio 1a, b).Kaikki rekombinantin spidroiinin testatut fraktiot muodostivat geelejä (proteiinipitoisuudella 300 mg/ml) alle 1 tunnissa, paitsi saostunut 2Rep (kuvio 1b).Tämä viittaa siihen, että NT ja CT yksinään, yhdistelmänä tai yhdistettynä toistoihin, voivat geeliytyä 37 °C:ssa ja että His6-merkki ei vaikuta tähän prosessiin merkittävässä määrin.Ottaen huomioon yleinen käsitys, että NT on erittäin liukeneva ja stabiili proteiini ja että aiemmat raportit rekombinanteista spidroiinihydrogeeleistä ovat katsoneet geeliytymisvaikutusten johtuvan konformaatiomuutoksista toistuvilla alueilla ja/tai CT:issä, NT itse voisi.Geelityksen löytö oli odottamaton.Täydentävä taulukko 1) 37, 38, 39. Huomattavaa on, että NT geeliytyi jo 10 minuutissa konsentraatiolla ≥ 300 mg/ml (kuvio 1c).Injektiopullon inversiokokeet erilaisilla NT-pitoisuuksilla osoittivat, että >50 mg/ml:ssa NT-liuos geeliytyi nopeammin kuin His-NT2RepCT vastaavalla konsentraatiolla (paino/tilavuus, kuvio 1c).
Kaavioesitys eri tässä työssä tutkituista spidroiinirakenteista.b Geelittymisaika 37 °C:ssa useille yhdistelmä-DNA-teknisille spidroiiniproteiineille (300 mg/ml) varmistettu kääntämällä pullo ylösalaisin.CT-geeli välittömästi ilman inkubaatiota (<300 mg/ml), 2Rep saostuu (300 mg/ml, 5 mm mittakaava).c His-NT2RepCT:n ja NT:n geeliytymisaika osoitetuilla proteiinipitoisuuksilla 37 °C:ssa.d Valokuvia His-NT2RepCT- ja NT-hydrogeeleistä, joiden alapuolelle on painettu hämähäkki ja kirjain "NT" (molemmat 200 mg/ml, asteikko 5 mm).
Erilaisten rekombinanttien spidroiiniproteiinien muodostamilla hydrogeeleillä on hieman erilaiset värit, ja paljain silmin tarkkailu osoittaa vaihtelevaa läpinäkyvyysastetta (kuvio 1b).NT-geelit ovat poikkeuksellisen kirkkaita, kun taas muut geelit muuttuvat läpinäkymättömiksi.Sylinterimäisiin putkiin valetut His-NT2RepCT- ja NT-geelit voitiin poistaa muotista ehjinä (kuva 1d).
Sen testaamiseksi, geeliytyvätkö luonnolliset hämähäkin silkkipinnoitteet olosuhteissa, joiden on nyt havaittu aiheuttavan yhdistelmä-DNA-teknisten spidroiiniproteiinien geeliytymistä, pinnoitteet kerättiin ruotsalaisen siltahämähäkin (Larinioides sclopetarius) suuresta ampullarauhasesta.Pinnoitteet säilytettiin 20 mM Tris-HCl-puskurissa pitoisuudella 50 mg/ml (perustuen mitattuun kuivapainoon), mutta geeliytymistä ei havaittu 21 päivän inkuboinnin aikana 37 °C:ssa (lisäkuva 2a).
Näiden geelien kvantifioimiseksi voidaan käyttää reologisia mittauksia geeliytymisprosessin tutkimiseen ja yleisten mekaanisten ominaisuuksien määrittämiseen.Erityisesti varastointimoduulin (elastisuuden) tarkkailu korotetuissa lämpötiloissa voi antaa tietoa geeliytymislämpötilasta sekä pinnoitteen viskoelastisista ominaisuuksista.Lämpötilan nousukokeet (käyttämällä 1°C/min 25-45°C:ssa, perustuen aikaisempiin tutkimuksiin luonnonsilkkipohjaliuoksilla)40,41 osoittivat, että His-NT2RepCT- ja NT-liuosten varastointimoduulit lisääntyivät lämpötilan noustessa.lisääntyi (kuvio 2 ja täydentävä kuva 3).Erityisesti NT-moduuli alkoi kasvaa alemmassa lämpötilassa verrattuna His-NT2RepCT:hen, mikä on yhdenmukainen nopeamman geeliytymisajan kanssa, joka havaittiin, kun NT:tä inkuboitiin suoraan His-NT2RepCT:n kanssa 37 °C:ssa (kuvio 1).Myöhemmin tapahtuneen lämpötilan laskun jälkeen varastointimoduuli ei palannut alhaisempiin arvoihin ja pysyi häviömoduulin yläpuolella (katso lisäkuva 3), mikä osoittaa termisesti palautumatonta stabiilia geeliytymistä.Geelityksen jälkeen lopullinen kimmomoduuli vaihteli välillä 15-330 kPa His-NT2RepCT-hydrogeelien konsentraatiolla 100-500 mg/ml, ja lopullinen kimmomoduuli NT-hydrogeelien (100-500 mg/ml) välillä 2-1400 kPa (kuva , 2 ja täydelliset ramppitiedot), katso lisäkuva 3).
a Lämpötilan muutos His-NT2RepCT:n (300 mg/ml) ja b NT:n (300 mg/ml) mittausten aikana ravistellen.Nuolet osoittavat lämpötilatrendiä, ja tallennusmoduulitietojen vaaleampi varjostus kuvaa testaamista laitteen valmistajan ilmoittamaa pienemmillä vääntömomenttiarvoilla, mikä on syynä kohonneeseen kohinaan.c His-NT2RepCT:n ja NT:n loppumoduulin kerääntyminen kohonneen lämpötilan (100, 300 ja 500 mg/ml) jälkeen.Kaikki moduulilukemat otetaan 0,1 Hz:n taajuudella.
Mahdollisena menetelmänä geeliytymiseen liittyvien konformaatiomuutosten tutkimiseen rekisteröimme His-NT2RepCT:n ja NT:n FTIR-spektrit ennen ja jälkeen geeliytymisen 37 °C:ssa (kuva 3a, b).Kuten odotettiin, His-NT2RepCT- ja NT-liuosten spektrit vastasivat proteiineja, joilla oli a-heliksi/satunnainen kierukka toissijainen rakenne, jossa oli selvä vyöhyke 1645 cm-1:ssä.Molemmille hydrogeeleille geeliytyminen johti kahden haaran muodostumiseen keskimmäiselle I-vyöhykkeelle noin 1617 cm-1:ssä ja 1695 cm-1:ssä (kuvio 3a, b), mikä osoittaa antirinnakkaisten p-arkkirakenteiden muodostumisen.Nämä muutokset voidaan myös nähdä selvästi vastaavissa toisissa johdannais- ja erogeeliytymisspektreissä (täydentävä kuva 4b).NT β-kerroksen kaksi vyöhykettä olivat selvempiä kuin His-NT2RepCT:n, mikä osoittaa, että β-kerroksen vyöhykkeiden kokonaispitoisuus NT-hydrogeelissä oli korkeampi kuin NT2RepCT-hydrogeelin.
His-NT2RepCT:n ja bNT:n (molemmat 500 mg/ml) FTIR-absorptiospektrit ennen inkubaatiota (liuos) ja sen jälkeen (geeli) 37 °C:ssa.c TEM-kuvat uudelleen suspendoiduista 50 mg/ml NT2RepCT-geeleistä ja d NT:stä.Mittakaava 200 nm.e His-NT2RepCT- ja NT-hydrogeelien kuitujen halkaisijat.n = 100 mitattua fibrilliä, p < 0,0001.Virhepalkit näyttävät keskihajonnan.Virhepalkkien keskikohta on keskiarvo.Tilastolliseen analyysiin käytettiin paritonta t-testiä (kaksipyrstöä).f Erilaisten rekombinanttien spidroiiniproteiinien (100 mg/ml) ThT-fluoresenssi 37 °C:ssa ravistamatta.g NT (100 mg/ml) siirrostuskokeet 100 mg/ml NT-geelistä 0 %, 5 %, 10 % ja 20 % siemenillä.
Geelin analyysi transmissioelektronimikroskoopilla (TEM) osoitti, että hydrogeeli koostuu amyloidin kaltaisista fibrilleistä (kuviot 3c, 3d).NT:n muodostamat fibrillit olivat pitkulaisia ​​(halkaisijaltaan 5–12 nm) ja haarautumattomia, kun taas His-NT2RepCT-fibrillit olivat pituudeltaan lyhyempiä ja halkaisijaltaan merkittävästi leveämpiä (7–16 nm) (kuva 3e).Nämä tulokset antoivat meille mahdollisuuden seurata fibroosin kinetiikkaa käyttämällä tioflaviini T (ThT) -määritystä.Kaikkien rekombinanttien spidroiiniproteiinien fluoresoiva signaali lisääntyi, kun näytteitä inkuboitiin 37 °C:ssa (kuva 3f, täydentävä kuva 5a).Tämän havainnon mukaisesti NT:n ja His-NT2RepCT:n mikroskooppinen tutkimus geeliytymisolosuhteissa paljasti tasaisen kasvun ThT-fluoresenssissa ilman havaittavaa ThT-positiivisten aggregaattien paikallista kertymistä (täydentävä kuva 5b, c).ThT-positiivisten fibrillien muodostumiseen ei liittynyt NT- ja His-NTCT-sameuden lisääntymistä (täydentävä kuva 5d), mikä tarkoittaa, että geelissä voi muodostua fibrilliverkosto vaarantamatta geelin kirkkautta.Kylvö lisäämällä pieniä määriä esimuodostettuja fibrillejä voi merkittävästi nopeuttaa joidenkin amyloidien fibrillien muodostumista42,43,44, mutta lisäämällä 5%, 10% tai 20% (w/w) NT NT-hydrokoagulanttien liuokseen.kylvövaikutus (kuva 3g).Ehkä tämä johtuu siitä, että hydrogeelin fibrillit ovat suhteellisen kiinteitä eikä niitä voida käyttää siemeninä.
Rekombinanttien spidroiiniproteiinien odottamaton käyttäytyminen korkeissa lämpötiloissa sai aikaan lisäydinmagneettiresonanssin (NMR) spektroskopiatutkimuksia geelin muodostukseen liittyvien konformaatiomuutosten tunnistamiseksi.His-NT2RepCT-liuosten NMR-spektrit, jotka tallennettiin ajan mittaan 37 °C:ssa, osoittivat, että CT oli edelleen osittain taittunut, kun taas NT- ja 2Rep-signaalit olivat kadonneet (kuva 4a), mikä viittaa siihen, että pääasiassa NT ja 2Rep kontrolloivat osittain His- NT2RepCT hydrogeeli.CT-signaali vaimennettiin myös 20 prosenttiin alkuperäisestä voimakkuudestaan, mikä viittaa siihen, että CT on myös enimmäkseen kiinteä ja sisällytetty hydrogeelirakenteeseen.Pienemmällä osalla CT:tä, joka on yhtä liikkuva kuin esi-inkuboidussa näytteessä ja siten havaittu liuoksen NMR:llä, spektreistä puuttuu signaaleja ensimmäisille 10 strukturoidulle jäännökselle, mahdollisesti johtuen His-NT2Rep:n kiinnitetyn osan vaikeasta immobilisoinnista.Hydrogeelien -NT2RepCT-tilan NMR-spektrit paljastivat vallitsevan a-heliksien ja p-kerrosten läsnäolon ja vähemmässä määrin satunnaiskelan konformaation (kuvio 4b).Vain NT:ssä läsnä olevien metioniinitähteiden kemiallinen siirtymäanalyysi osoitti, että tämä domeeni oli muunnettu p-levyrakenteeksi.Liuoksessa olevan NT:n ajasta riippuvaiset spektrit osoittivat tasaista signaalin intensiteetin laskua (kuvio 4c), ja NT-hydrogeelien kiinteän olomuodon NMR osoitti, että suurin osa NT-tähteistä muuttui β-levyrakenteiksi (kuvio 4d).2Rep:n konformaatiota ei voitu määrittää erikseen, koska sillä on taipumus aggregoitua.NTCT- ja His-NT2RepCT-hydrogeelien kiinteän olomuodon NMR-spektrit näyttivät kuitenkin hyvin samanlaisilta (kuvio 4b; täydentävä kuva 6b), mikä viittaa siihen, että 2Rep vaikutti vähän His-NT2RepCT-hydrogeelin rakenteelliseen osaan.CT-hydrogeeleillä havaittiin olevan α-kierteitä, β-levyjä ja satunnaisia ​​kierteisiä sekundaarisia rakenteita (täydentävä kuva 6d).Tämä viittaa siihen, että jotkin CT:n osat pysyvät α-kierteinä, kun taas toisista tulee β-levyjä.Täten NMR-spektroskopian tulokset viittaavat siihen, että NT on tärkeä hydrogeelin muodostukselle ja myös muuttuu β-levykonformaatioksi fuusioituessaan 2Rep:n ja CT:n kanssa.Tämän mukaisesti havaitsimme äskettäin, että amyloidiset spatiaaliset vetoketjut muodostuvat todennäköisesti NT-alueen kaikissa viidessä heliksissä, ja Waltz-algoritmi ennusti amyloidogeenisen alueen heliksissä 1 (kuva 4e).
15N-HSQC 10 mg/ml His-NT2RepCT-liuoksen 2D-spektrit ennen (sininen) ja 19 tuntia inkuboinnin jälkeen (punainen) 37 °C:ssa.Yksittäiset ristipiikit punaisessa spektrissä ja F24, G136, polyA sinisessä spektrissä on merkitty yksikirjaimilla aminohapposymboleilla ja tähteiden numeroilla.Sisäosat osoittavat signaalin intensiteetin riippuvuuden ajasta valituille tähteille NT-, 2Rep- ja CT-alueista.b His-NT2RepCT-hydrogeelien solid-state radiotaajuusspektrit (RFDR).RFDR-spektreissä havaittujen Cα/Cβ-tähteiden korrelaatiot määritettiin vertaamalla mallipeptidien kemiallisia siirtymiä ja tilastoista johdettuja arvoja82,83 ja niiden sekundaarirakenteita.SSB – pyörivä sivunauha.c 15N-HSQC 10 mg/ml NT-liuoksen yksiulotteiset spektrit inkuboinnin aikana 37 °C:ssa 36 tunnin ajan.Inset näyttää volyymin intensiteetin ajan funktiona.d NT-hydrogeelien kiinteän olomuodon RFDR-spektrit.RFDR-spektreissä havaitut Ca/Cp-tähteiden ja niiden toissijaisten rakenteiden korrelaatiot on osoitettu.e Perustuu Zipper-tietokannan NT45.79 fibrillaatioalttiusprofiiliin (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Heksapeptidin avaruudellisen salamansiirtoikkunan Rosetta-energia esitetään kcal/mol.Punaiset palkit osoittavat heksapeptidejä, joilla on korkea fibroosialttius (Rosetta-energia alle -23 kcal/mol; katkoviivan alapuolella).Vihreät palkit osoittavat fragmentteja, joiden Rosetta-energia ylittää kynnyksen, ja siksi ne muodostavat vähemmän todennäköisesti steerisiä vetoketjuja.Proliinia sisältävät fragmentit jätettiin pois analyysistä (ilman sarakkeita).Neliöt osoittavat Waltz-algoritmin81 (https://waltz.switchlab.org) ennustamia amyloidoosialueita.NT:n aminohappotähteiden sekvenssi on yläosassa, ja β-sekundaarirakenteessa (määritetty kiinteän olomuodon NMR-spektroskopialla) löydetyt tähteet on esitetty punaisella.Viiden NT a-heliksen paikat on merkitty (H1-H5)28.
pH:ssa <6,5 HT dimeroituu ja kestää lämmön tai urean aiheuttamaa denaturaatiota18.Sen selvittämiseksi, kuinka NT:n dimeroituminen ja stabiilisuus vaikuttavat geeliytymiseen, liuokset, jotka sisälsivät 100 mg/ml NT:tä, säädettiin pH-arvoihin 8, 7 ja 6 käyttämällä injektiopullon inversiotestiä.pH-arvoissa 8 ja 7 inkuboidut NT-näytteet geeliytyivät 30 minuutin kuluttua 37 °C:ssa, mutta pH 8 -geeli pysyi kirkkaana, kun taas pH 7 -geelissä oli näkyvä sakka (kuvio 5a).Sitä vastoin liuos, joka sisälsi HT:ta pH:ssa 6, ei muodostanut geeliä, ja suuri sakka voitiin nähdä 20 minuutin kuluttua 37 °C:ssa.Tämä viittaa siihen, että dimeerit itse ja/tai niiden korkeampi stabiilisuus verrattuna monomeereihin estävät geeliytymisen.Saostuman muodostumista NT:lle pH-arvoissa 7 ja 6 ei ollut odotettavissa, koska on raportoitu, että NT liukenee pitoisuudessa 200 mg/ml27, laskostuu helposti uudelleen lämpödenaturoinnin jälkeen ja säilyttää myös α-kierteen alemmilla arvoilla pH 18. Todennäköinen selitys näille eroille on se, että aiemmin raportoidut kokeet suoritettiin huoneenlämpötilassa tai sen alapuolella tai suhteellisen alhaisilla proteiinipitoisuuksilla16,18,19.
NT-pullon inversiotesti (100 mg/ml) pH:ssa 8, 7, 6 ja 154 mM NaCl:ssa (pH 8) 37 °C:ssa inkuboinnin jälkeen.b NT CD -spektrit 154 mM NaF:n ja 154 mM NaCl:n kanssa ja ilman.Molaarinen elliptisyys aallonpituudella 222 nm muunnetaan luonnollisten poimujen suhteeksi.c NT-inversiomääritys (100 mg/ml) NT* (37 °C ja 60 °C), NTA72R (37 °C) ja His-NT-L6 (37 °C ja 60 °C).d NT-mutanttien NT*, NTA72R ja His-NT-L6 CD-spektrit.Molaarinen elliptisyys aallonpituudella 222 nm muunnetaan luonnollisten poimujen suhteeksi.e NTFlSp:n, NTMiSp:n ja pelkistetyn NTMiSp:n (100 mg/ml) inversiotesti.Mittakaava 5 mm.f NT:n, NTFlSp:n, NTMiSp:n ja pelkistetyn NTMiSp:n CD-spektrit.Molaarinen elliptisyys aallonpituudella 222 nm muunnetaan luonnollisten poimujen suhteeksi.Täydet NT-spektrit 25 °C:ssa ja 95 °C:ssa on esitetty lisäkuvassa 8.
Fysiologinen suolapitoisuus määrää NT-alayksiköiden väliset sähköstaattiset vuorovaikutukset ja NT:n siirtymisen dimerisoitumisen alempaan pH-arvoon18.Havaitsimme, että 154 mM NaCl:n ja NaF:n läsnäolo todellakin esti geeliytymistä, vastaavasti (kuvat 5a, b; täydentävä kuva 2b) ja että nämä suolat lisäsivät NT-monomeerien lämpöstabiilisuutta (kuva 5b, täydentävä kuva 8). .Se viittaa myös siihen, että stabiilisuuden lisääminen dimeroitumisen sijaan estää geelin muodostumista.
Tutkiaksemme edelleen proteiinin dimerisoitumisen ja stabiilisuuden roolia geeliytymisessä käytimme kahta mutanttia, NT* ja NTA72R, jotka myös pysyvät monomeerisinä alhaisessa pH:ssa 28,30.NT* on kaksoisvarauksen käänteismutantti, jossa monomeerin näennäinen dipolaarinen varausjakauma on litistynyt, mikä estää dimerisoitumisen ja lisää dramaattisesti monomeerin stabiilisuutta.NTA72R on varautunut dipoli, mutta Arg-substituoitu Ala sijaitsee dimeerin rajalla, joten mutaatiot häiritsevät dimerisaatioon tarvittavia alayksikkövuorovaikutuksia.Inkuboitaessa 37 °C:ssa NT* ei muodostanut hydrogeeliä, kun taas NTA72R muodosti läpinäkymättömän geelin 15 minuutin ajan (kuvio 5c).Koska sekä NT* että NTA72R eivät voi dimeroitua, mutta eroavat monomeerin stabiiliudesta (kuvio 5d), nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että korkea termodynaaminen stabiilisuus estää NT:tä geeliytymästä.Tätä tukee myös se tosiasia, että HT* muodostaa geelin, kun se on epästabiili korkeassa lämpötilassa (8 minuutin kuluttua 60 °C:ssa; kuva 5c).Aiemmin on osoitettu, että NT:n korkea metioniinipitoisuus nesteyttää sen luonnollisen laskostumisen ja että kuusi Met-Leu-korviketta (jota kutsutaan tässä nimellä His-NT-L6) stabiloivat voimakkaasti NT46-monomeeriä.Perustuen olettamukseen, että rakenteellista joustavuutta tarvitaan NT-geelin muodostukseen, havaitsimme, että His-NT-L6-stabiili mutantti ei geelinnyt 37 °C:ssa (kuvio 5c, d).His-NT-L6 muodosti kuitenkin myös geelin inkuboitaessa 60 °C:ssa 60 minuuttia (kuvio 5c).
NT:n kyky muuttua β-levyrakenteiksi ja muodostaa hydrogeelejä näyttää pätevän joihinkin, mutta ei kaikkiin spidroiinin NT-domeeneihin.Eri silkkityypeistä ja hämähäkkilajeista peräisin olevat NT:t, Trichonephila clavipes (NTFlSp), muodostivat geelejä huolimatta suhteellisen alhaisesta metioniinipitoisuudesta ja korkeasta lämpöstabiilisuudesta (kuvat 5e, f ja täydentävä taulukko 2).Sitä vastoin Araneus ventricosuksen (NTMiSp) pienestä ampullaarisesta spidroiinista peräisin oleva NT, jolla on alhainen lämpöstabiilisuus ja korkea metioniinipitoisuus, ei muodostanut hydrogeelejä (lisätaulukko 2 ja kuva 5e, f).Jälkimmäinen voi liittyä molekyylin sisäisten disulfidisidosten esiintymiseen29,47.Johdonmukaisesti, kun NTMiSp:n disulfidisidokset pelkistettiin, se muodosti hydrogeelin 37 °C:ssa 10 minuutin inkuboinnin jälkeen (kuvio 5e).Lopuksi on huomattava, että rakenteellinen joustavuus on tärkeä, mutta ei ainoa kriteeri geelin muodostukselle NT:stä.Toinen tekijä, joka voi olla merkityksellinen, on taipumus muodostaa amyloidifibrillejä, ja analyysi vetoketjutietokannan ja Waltz-algoritmin kanssa osoitti korrelaation geelinmuodostuskyvyn ja amyloidogeenisten alueiden läsnäolon välillä sekä ennustettujen alueiden laajuuden välillä. muodostamaan steerisiä vetoketjuja.Siinä oli korrelaatio (lisätaulukko 2 ja täydentävä kuva 9).
NT:n kyky muodostaa fibrillejä ja geelejä suotuisissa olosuhteissa sai meidät olettamaan, että NT-fuusiot muiden proteiinifragmenttien kanssa voivat silti muodostaa geelejä, joissa fuusiopartnerit toimivat täysin.Tämän testaamiseksi otimme käyttöön vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) ja puriininukleosidifosforylaasin (PNP) vastaavasti NT:n C-päähän.Tuloksena saadut fuusioproteiinit ekspressoitiin E. colissa erittäin korkeilla lopullisilla saannoilla (150 mg/l ja 256 mg/l ravistelupulloviljelmät His-NT-GFP:lle ja His-NT-PNP:lle, vastaavasti), mikä on yhdenmukainen sen kanssa, mitä on osoitettu muille NT:hen fuusioiduille proteiineille Ref.30. His-NT-GFP (300 mg/ml) ja His-NT-PNP (100 mg/ml) fuusioproteiinit muodostivat geelejä 2 tunnin ja 6,5 ​​tunnin jälkeen 37 °C:ssa, ja mikä tärkeintä, GFP-fraktio pysyi muuttumattomana.havaittiin geeliytymisen jälkeen, jolloin >70 % alkuperäisestä fluoresenssin intensiteetistä oli jäljellä geeliytymisen jälkeen (kuvio 6a).PNP-aktiivisuuden mittaamiseksi his-NT-PNP-liuoksissa ja -geeleissä meidän piti laimentaa fuusioproteiini NT:llä, koska puhtaan valmisteen entsymaattinen aktiivisuus oli määrityksen havaitsemisalueen ulkopuolella geeliytymispitoisuuksilla.Geeli, joka muodostui seoksesta, joka sisälsi 0,01 mg/ml His-NT-PNP:tä ja 100 mg/ml NT:tä, säilytti 65 % esi-inkuboitujen näytteiden alkuperäisestä entsymaattisesta aktiivisuudesta (kuvio 6b).Geeli pysyi ehjänä mittauksen aikana (lisäkuva 10).
Suhteellinen fluoresenssin intensiteetti ennen His-NT-GFP:n (300 mg/ml) ja ylösalaisin käännetyn His-NT-GFP-hydrogeeliä (300 mg/ml) sisältävän injektiopullon geeliytymistä ja sen jälkeen näkyvässä ja UV-valossa.Pisteet näyttävät yksittäisiä mittauksia (n = 3), virhepalkit keskihajonnan.Keskiarvo näkyy virhepalkkien keskellä.b PNP-aktiivisuus saatiin fluorometrisellä analyysillä käyttämällä liuoksia ja geelejä, jotka koostuivat NT:stä (100 mg/ml) ja seoksesta, joka sisälsi 0,01 mg/ml his-NT-PNP:tä ja 100 mg/ml New Taiwanin dollareita.Sisäpuolella on ylösalaisin käännetty injektiopullo, joka sisältää His-NT-PNP:tä sisältävää hydrogeeliä (5 mm:n asteikkopalkki).
Tässä raportoimme hydrogeelien muodostumisen NT:stä ja muista rekombinanteista spidroiiniproteiineista inkuboimalla proteiiniliuosta 37 °C:ssa (kuva 1).Osoitamme, että geeliytyminen liittyy a-heliksien muuttumiseen p-kerroksiksi ja amyloidin kaltaisten fibrillien muodostumiseen (kuvat 3 ja 4).Tämä havainto on yllättävä, koska NT:t ovat kierrettyjä pallomaisia ​​viiden kierteen kimppuja, jotka tunnetaan erittäin korkeasta liukoisuudestaan ​​​​ja korkeasta stabiilisuudestaan ​​​​konsentraatioissa > 200 mg/ml 4 °C:ssa useiden päivien ajan27.Lisäksi NT:t laskostuvat helposti uudelleen lämpödenaturoinnin jälkeen alhaisilla proteiinipitoisuuksilla µM.Tulostemme mukaan fibrillien muodostuminen vaatii >10 mg/ml proteiinipitoisuuden ja hieman kohonneen lämpötilan yhdistelmän (kuva 1).Tämä on yhdenmukainen sen ajatuksen kanssa, että amyloidifibrillejä voi muodostua pallomaisesti laskostuneista proteiineista, jotka ovat osittain laskostumattomassa tilassa fysiologisten olosuhteiden lämpövaihtelujen vuoksi 48 .Esimerkkejä proteiineista, jotka läpikäyvät tämän konversion, ovat insuliini49,50, p2-mikroglobuliini, transtyretiini ja lysotsyymi51,52,53.Vaikka NT on natiivissa tilassaan a-heliksi, noin 65 % polypeptidiketjusta on yhteensopiva steerisen vetoketjun muodostuksen kanssa (kuvio 4e) 45 .Koska monomeeri on dynaamisesti liikkuva46, se voi paljastaa nämä mahdolliset amyloidogeeniset alueet kohtalaisen kohotetuissa lämpötiloissa ja korkeilla kokonaisproteiinipitoisuuksilla voi saavuttaa kriittisen pitoisuuden amyloidifibrillien muodostumiselle54.Tämän päättelyn jälkeen havaitsimme negatiivisen korrelaation spidroiinipitoisuuden ja geeliytymisajan välillä (kuva 1c), ja jos monomeerinen NT-konformaatio stabiloituu joko mutaatioilla (NT*, His-NT-L6) tai suolan lisäyksellä, se voi estää muodostaa hydrogeelejä (kuvio 5).
Useimmissa tapauksissa amyloidifibrillit katoavat liuoksesta sakana, mutta tietyissä olosuhteissa ne voivat muodostaa hydrogeelejä55,56,57.Hydrogeeliä muodostavilla fibrilleillä on tyypillisesti korkea kuvasuhde ja ne muodostavat stabiileja kolmiulotteisia verkkoja molekyylien takertumisen kautta, 55, 58 tulostemme mukaisesti.Hydrogeelin muodostusta varten in vitro proteiinit laskostuvat usein kokonaan tai osittain auki esimerkiksi altistumalla orgaanisille liuottimille, korkealle lämpötilalle (70–90°C) ja/tai alhaiselle pH:lle (1,5–3,0)59,60,61,62.Tässä kuvatut spidroiinihydrogeelit eivät vaadi kovaa käsittelyä eivätkä ne vaadi silloitusaineita hydrogeelien stabiloimiseksi.
Aiemmin on raportoitu, että spidroiinitoistot ja QD:t, jotka näyttävät käyvän läpi β-levyn vaihdon silkin kehruun aikana, muodostavat hydrogeelejä.Löytöihimme verrattuna inkubointiajat ja/tai inkubointilämpötilat olivat vastaavasti merkittävästi pidempiä tai korkeampia, ja tuloksena saadut hydrogeelit olivat usein läpinäkymättömiä (kuva 7 ja täydentävä taulukko 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Nopeiden geeliytymisaikojen lisäksi NT-hydrogeelit >300 mg/ml (30 %) ylittivät kaikki muut kuvatut rekombinanttihämähäkkisilkkiproteiinihydrogeelit sekä luonnolliset hydrogeelit, kuten gelatiini, alginaatti (2 %), agar (0,5 % ) ja kollageeni.(0,6 %) (Kuva 7 ja lisätaulukot 1 ja 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Hydrogeelien geeliytymisaikaa ja kimmomoduulia verrattiin tässä tutkimuksessa muihin spidroiinipohjaisiin hydrogeeleihin ja valikoituihin luonnonhydrogeeleihin.Viitteet annetaan yhdessä geeliytymisolosuhteiden kuvauksen kanssa.APS Ammoniumpersulfaatti, huoneenlämpöinen.Tiedot 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Hämähäkit näyttävät kehittäneen tapoja estää spidroiinin geeliytymistä varastoinnin aikana.Huolimatta korkeasta proteiinipitoisuudesta silkkirauhasessa, terminaalidomeeniin liittyvä suuri toistoalue tarkoittaa, että NT:n ja CT:n näennäinen pitoisuus rauhasessa vastaa noin 10-20 mg/ml tämän tutkimuksen rajalla.tarvitaan in vitro havaittuun hydrogeelin muodostukseen.Lisäksi samanlaiset suolapitoisuudet 16 stabiloivat NT:tä, kuten silkkirauhasissa (kuvio 5b).NT-konformaatiota on tutkittu E. colin sytosolissa ja sen on havaittu olevan tiukemmin laskostunut kuin in vitro tutkittaessa, mikä osoittaa edelleen, että suola tai muut tekijät estävät sen aggregoitumista in vivo.NT:iden kyky muuttua β-levyfibrilleiksi voi kuitenkin olla tärkeä filamentin muodostumiselle, ja sitä tulisi tutkia tulevissa tutkimuksissa.
Tässä tutkimuksessa havaittujen NT-amyloidin kaltaisten fibrillien ja hydrogeelin muodostumisen uusien näkökohtien lisäksi osoitamme myös, että tällä ilmiöllä voi olla bioteknisiä ja biolääketieteellisiä sovelluksia (kuva 8).Todisteeksi konseptista yhdistimme NT:n GFP:hen tai PNP:hen ja osoitimme, että fuusioproteiini muodostaa myös hydrogeelejä, kun sitä inkuboidaan 37 °C:ssa ja että GFP- ja PNP-fraktiot säilyttävät aktiivisuutensa suurelta osin geeliytymisen jälkeen (kuva 6).Nukleosidifosforylaasit ovat tärkeitä katalyyttejä nukleosidianalogien synteesissä75, mikä tekee löydöstämme merkityksellisen biolääketeollisuudelle.Käsite ekspressoida fuusioproteiineja, jotka muodostavat läpinäkyviä hydrogeelejä suotuisissa olosuhteissa, mahdollistaa funktionalisoitujen hydrogeelejen luomisen, joilla on suotuisat ominaisuudet monenlaisiin sovelluksiin, kuten entsyymien immobilisointiin, kontrolloidusti lääkeaineen vapautumiseen ja kudosmuokkaukseen.Lisäksi NT ja NT* ovat tehokkaita ilmentymismarkkereita30, mikä tarkoittaa, että NT:tä ja sen muunnelmia voidaan käyttää liukoisten fuusioproteiinien korkean suorituskyvyn tuottamiseen ja myöhempään immobilisoitujen kohdeproteiinien luomiseen 3D-hydrogeeleissä.
NT on liukoinen, α-kierteinen ja stabiili alhaisissa pitoisuuksissa (µM) ja 37 °C:ssa.Samassa lämpötilassa, mutta kasvavilla pitoisuuksilla (>10 mg/ml), NT muodostaa geelejä, jotka koostuvat amyloidin kaltaisista fibrilleistä.NT-fuusioproteiinit muodostavat myös fibrillaarisia geelejä, joissa on täysin toimivia fuusiofragmentteja, mikä mahdollistaa eri proteiinien immobilisoinnin 3D-hydrogeeleihin NT:tä käyttämällä.Alhaalla: NT (PDB: 4FBS) ja kuvat kuituverkoista ja niihin liittyvistä proteiinirakenteista (oletettu ja ei ole piirretty mittakaavassa, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdpdbR).
Rakenteet (katso täydentävä taulukko 4 täydelliselle luettelolle, joka sisältää aminohapposekvenssit) kloonattiin plasmidiin pT7 ja transformoitiin E. coli BL21:een (DE3).Muokattuja plasmideja sisältäviä E. coli -bakteeria ympättiin Luria-liemessä, jota oli täydennetty kanamysiinillä (70 mg/l), ja kasvatettiin yön yli 30 °C:ssa ja 250 rpm:ssä.Viljelmä siirrostettiin sitten suhteessa 1/100 kanamysiiniä sisältävään LB-elatusaineeseen ja viljeltiin 30 °C:ssa ja 110 rpm:ssä, kunnes OD600 saavutti arvon 0,8.NMR-tutkimuksia varten bakteereja kasvatettiin M9-minimielatusaineessa, joka sisälsi 2 g D-glukoosia 13C (Aldrich) ja 1 g ammoniumkloridia 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) proteiinileimausta varten isotoopeilla.Laske lämpötila 20 celsiusasteeseen ja indusoi proteiinin ilmentyminen 0,15 mM isopropyylitiogalaktopyranosidilla (lopullinen pitoisuus).Yön yli tapahtuneen proteiiniekspression jälkeen solut kerättiin 7278 x g:ssä 4 °C:ssa 20 minuutin ajan.Solupelletit suspendoitiin uudelleen 20 mM Tris-HCl:ään, pH 8, ja jäädytettiin jatkokäyttöön asti.Sulatetut solut hajotettiin käyttämällä soluhajotinta (TS-sarjan koneet, Constant Systems Limited, Englanti) 30 kPa:ssa.Sitten lysaatteja sentrifugoitiin 25 000 g:ssä 30 minuuttia 4 °C:ssa.NTMiSp:lle pelletti suspendoitiin sitten uudelleen liuokseen 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, ja sonikoitiin 2 minuuttia (2 s päälle/pois, 65 %), sitten sentrifugoitiin uudelleen 25 000 xg:ssä, 4 °C:ssa. 30 min.Supernatantti ladattiin Ni-NTA-kolonniin, pestiin 20 mM Tris-HCl:lla, 2 mM imidatsolilla, pH 8, ja lopuksi proteiini eluoitiin liuoksella 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidatsoli, pH 8. NT2RepCT:n ja NTCT, trombiinin pilkkominen tuo paikan (ThrCleav) Hisin ja NT:n väliin.Trombiinin pilkkoutumiskohtia on myös kohdissa His-NT-ThrCleav-2Rep (tuottaa 2Rep), His-tioredoksiini-ThrCleav-NT (tuottaa NT), His-tioredoksiini-ThrCleav-CT (tuottaa CT:tä), His-tioredoksiini-NTThrCleav. .* (tuottaa NT*), His-Tioredoksiini-ThrCleav-NTA72R (tuottaa NTA72R), His-Tioredoksiini-ThrCleav-NTFlSp (tuottaa NTF1Sp) ja His-Rikki Redoksiini-ThrCleav-NTMiSp (tuottaa NTMiSp).Konstruktit digestoitiin trombiinilla (1:1000) ja dialysoitiin yön yli 4 °C:ssa 20 mM Tris-HCl:lla, pH 8, käyttäen Spectra/Por-dialyysikalvoa, jonka molekyylipainokynnys oli 6-8 kDa.Dialyysin jälkeen liuos ladataan Ni-NTA-kolonniin ja mielenkiinnon kohteena olevan proteiinin sisältävä effluentti kerätään.Proteiinipitoisuudet määritettiin mittaamalla UV-absorbanssi aallonpituudella 280 nm käyttämällä kunkin proteiinin ekstinktiokerrointa, paitsi NTF1Sp:lle, joka käytti Bradfordin määritystä valmistajan ohjeiden mukaisesti.Puhtaus määritettiin SDS-polyakryyliamidi (4–20 %) geelielektroforeesilla ja Coomassie briljanttisinisellä värjäyksellä.Proteiinit konsentroitiin käyttämällä sentrifugisuodattimia (VivaSpin 20, GE Healthcare) nopeudella 4000 xg 10 kDa:n molekyylipainorajalla 20 minuutin sykleissä.
Sulata proteiiniliuos ja pipetoi varovasti 150 µl 1 ml:n kirkkaaseen septumipulloon (8 x 40 mm Thermo Scientific).Putket suljettiin ja suljettiin parafilmillä haihtumisen estämiseksi.Näytteitä (n = 3) inkuboitiin 37 °C:ssa tai 60 °C:ssa ja käännettiin ajoittain ylösalaisin geeliytymisen havaitsemiseksi.Näytteitä, jotka eivät geeliytyneet, inkuboitiin vähintään viikon ajan.Vähennä NTMiSp-disulfidisidoksia 10 mM DTT:llä 10 µM proteiinia kohti.Luonnollisten hämähäkkisilkkipäällysteiden geeliytymisen analysoimiseksi ruotsalainen siltahämähäkki leikattiin, kaksi pääasiallista ampuloitua rauhasta asetettiin 200 µl:aan 20 mM Tris-HCl-puskuria pH 8 ja leikattiin, jotta pinnoite erottui rauhasista..Rauhasten sisältö liuotetaan puskuriin, 50 µl kuivapainon määritystä varten (inkuboimalla avoimia pulloja 60 °C:ssa vakiopainoon) ja 150 µl geeliytymistä varten 37 °C:ssa.
Mittausgeometria/työkalu on valmistettu ruostumattomasta teräksestä käyttämällä yhdensuuntaista levyä, jonka ylähalkaisija on 20 mm ja rako 0,5 mm.Lämmitä näyte 25 °C:sta 45 °C:seen ja takaisin 25 °C:seen nopeudella 1 °C minuutissa käyttämällä ruostumattomasta teräksestä valmistettua Peltier-levyä.Värähtelymittaukset suoritettiin taajuudella 0,1 Hz ja materiaalin lineaarisella viskoelastisella alueella 5 % ja 0,5 % jännityksellä näytteille 100 mg/ml ja 300–500 mg/ml.Käytä mukautettua kosteuskammiota haihtumisen estämiseksi.Tiedot analysoitiin Prism 9:llä.
Infrapunaspektrien (IR) keräämiseen huoneenlämpötilassa 800 - 3900 cm-1.ATR-laite, samoin kuin valopolku spektrometrin läpi, puhdistetaan kuivalla suodatetulla ilmalla ennen koetta ja sen aikana.Liuoksia (500 mg/ml veden absorptiohuippujen minimoimiseksi spektrissä) pipetoitiin kiteiden päälle ja geelejä (500 mg/ml) muodostettiin ennen mittausta ja siirrettiin sitten kiteisiin (n = 3).1000 skannausta tallennettiin resoluutiolla 2 cm-1 ja nollan käyttöjaksolla 2. Toinen derivaatta laskettiin käyttämällä OPUS:a (Bruker) käyttämällä yhdeksän pisteen tasoitusaluetta.Spektrit normalisoitiin samalle integraatioalueelle välillä 1720 ja 1580 cm-1 käyttämällä F. Mengesin "Spectragryph – Optical Spectroscopy Software" -ohjelmaa.ATR-IR-spektroskopiassa infrapunasäteen tunkeutumissyvyys näytteeseen on aaltoluvusta riippuvainen, mikä johtaa voimakkaampaan absorptioon pienemmillä aaltoluvuilla kuin suuremmilla aaltoluvuilla.Näitä vaikutuksia ei ole korjattu kuvioissa 1 ja 2 esitetyille spektreille.3, koska ne ovat hyvin pieniä (lisäkuva 4).Tämän luvun korjatut spektrit laskettiin Bruker OPUS -ohjelmistolla.
Periaatteessa proteiinikonformaatioiden kattava kvantifiointi on mahdollista amidi I -piikin sisällä olevien komponenttien luotettavan dekonvoluution jälkeen.Käytännössä kuitenkin esiintyy esteitä.Kohina spektrissä voi esiintyä (väärinä) huippuina dekonvoluution aikana.Lisäksi veden taipumisesta johtuva piikki osuu yhteen amidi I -piikin paikan kanssa ja voi olla samansuuruinen näytteille, jotka sisältävät suuren määrän vettä, kuten tässä tutkitussa vesipitoisessa geelissä.Siksi emme yrittäneet hajottaa täysin amidi I -piikkiä, ja havaintojamme tulisi harkita vain muiden menetelmien, kuten NMR-spektroskopian, tueksi.
Liuoksia, joissa oli 50 mg/ml NT:tä ja His-NT2RepCT:tä, geeliytyi yön yli 37 °C:ssa.Sitten hydrogeeli laimennettiin 20 mM Tris-HCl:lla (pH 8) pitoisuuteen 12,5 mg/ml, ravisteltiin hyvin ja pipetoitiin geelin rikkomiseksi.Seuraavaksi hydrogeeli laimennettiin 10 kertaa 20 mM Tris-HCl:lla (pH 8), 5 μl näytettä laitettiin formvarilla päällystettyyn kupariritilälle ja ylimääräinen näyte poistettiin imupaperilla.Näytteet pestiin kahdesti 5 ul:lla MilliQ-vettä ja värjättiin 1-prosenttisella uranyyliformiaatilla 5 minuutin ajan.Poista ylimääräinen tahra imukykyisellä paperilla ja kuivaa verkko sitten ilmassa.Näille ristikoille suoritettiin kuvantaminen käyttämällä FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN -laitetta, joka toimii 100 kV:lla.Kuvat tallennettiin x 26 500 ja x 43 000 suurennoksilla käyttämällä Veleta 2k × 2k CCD-kameraa (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Saksa).Jokaiselle näytteelle (n = 1) tallennettiin 10–15 kuvaa.ImageJ:tä (https://imagej.nih.gov/) käytettiin kuva-analyysiin ja kuitujen halkaisijoiden mittaamiseen (n = 100, eri kuidut).Prisma 9:llä suoritettiin parittomia t-testejä (kaksipyrstö).Keskimääräiset His-NT2RepCT- ja NT-fibrillit olivat 11,43 (SD 2,035) ja 7,67 (SD 1,389) nm, vastaavasti.Luottamusväli (95 %) on -4,246 - -3,275.vapausasteet = 198, p < 0,0001.
80 ui nestemäisiä näytteitä, jotka sisälsivät 10 uM tioflaviini T:tä (ThT), mitattiin kolmena rinnakkaisena (n = 3) staattisissa olosuhteissa käyttämällä Corningin 96-kuoppaisia ​​mustapohjaisia ​​kirkaspohjaisia ​​levyjä (Corning Glass 3881, USA).Fluoresenssierot rekisteröitiin käyttämällä 440 nm:n virityssuodatinta ja 480 nm:n emissiosuodatinta (FLUOStar Galaxy, BMG Labtech, Offenburg, Saksa).ThT-signaali ei kyllästynyt eikä sammunut, koska kokeita ThT:n eri pitoisuuksilla suoritettiin muuttamatta signaalin intensiteettiä.Tallenna absorbanssi 360 nm:ssä sameuden mittausta varten.Ympätyskokeita varten muodostettiin 100 mg/ml geelejä 37 °C:ssa, suspendoitiin uudelleen ja käytettiin kylvämiseen moolisuhteilla 5 %, 10 % ja 20 %.Tiedot analysoitiin Prism 9:llä.
Sulata His-NT2RepCT- ja NT-varastot >100 mg/ml jäillä ja suodata 0,22 µm:n suodattimen läpi.Pitoisuudet laskettiin mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 280 nm käyttämällä Nanodroppia.96-kuoppaisen mustan sitoutumattoman levyn (Corning), jonka pohja oli kirkas, kuopissa näytteet laimennettiin pitoisuuteen 20 mg/ml 20 mM Tris-HCl:ssa pH 8 ja sekoitettiin 5 µM ThT:hen (lopullinen pitoisuus), näytteen kokonaispitoisuus. 50 μl tilavuus.Näytteet kuvattiin 10 minuutin välein 37 °C:ssa CellObserver (Zeiss) -mikroskoopilla, jossa oli läpäisyvalokanava ja FITC-viritys- ja emissiosuodatinsarjat ThT-kuvausta varten.Kuvaamiseen käytetään 20x/0,4 objektiivia.Kuva-analyysiin käytettiin Zen Blue (Zeiss) ja ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Geelejä valmistettiin myös NT- ja His-NT2RepCT-liuoksista pitoisuuksina 50 mg/ml, jotka sisälsivät 20 mM Tris pH 8 ja 5 uM ThT, ja inkuboitiin 37 °C:ssa 90 minuuttia.Geelipalat siirrettiin uuteen kuoppaan, joka sisälsi 20 mM Tris, pH 8 ja 5 µM ThT, ei-sitoutuvalle mustalle 96-kuoppaiselle kirkkaalle pohjalevylle.Ota vihreä fluoresenssi ja kirkkaat kenttäkuvat 20x/0,4 suurennuksella.ImageJ:tä käytettiin kuva-analyysiin.
Liuoksen NMR-spektrit saatiin 310 K:ssa 600 MHz Bruker Avance Neo -spektrometrillä, joka oli varustettu QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) -kryokoettimella.NMR-näytteet, jotka sisältävät 10 mg/ml homogeenista proteiinia, joka on leimattu 13C:lla, 15N, liuotettuna 20 mM Tris-HCl:iin (pH 8), 0,02 % (w/v) NaN3, 5 % DO (v/v), (n = 1) .NT2RepCT:n kemiallisia siirtymiä pH:ssa 6,7 ​​käytettiin pikin 23 osoittamiseen 15N-HSQC:n 2D-spektrissä.
13C, 15N-leimattujen hydrogeelien maagisen kulman pyörivän kiinteän NMR (MAS) -spektrit tallennettiin Bruker Avance III HD -spektrometrillä 800 MHz:llä, joka oli varustettu 3,2 mm:n 13C/15N{1H} elektronittomalla koettimella.Näytteen lämpötilaa säädettiin käyttämällä vaihtelevan lämpötilan kaasuvirtaa 277 K:ssa. Kaksiulotteinen dipolin rotaatioresonanssi (DARR)76 ja radiotaajuus uudelleenkytkentä (RFDR)77 -spektrit hankittiin MAS-taajuuksilla 12,5 kHz ja 20 kHz, vastaavasti.Ristipolarisaatio (CP) 1H:sta 13C:seen suoritettiin käyttämällä lineaarista ramppia 60,0 - 48,0 kHz 1H:ssa, 61,3/71,6 kHz 13C:ssa (12,5/20 kHz MAS) ja kosketusaikaa 0,5-1 ms.Tiedonkeruun aikana käytettiin Spinal6478-erotusta 73,5 kHz:llä.Keräysaika oli 10 millisekuntia ja syklin viive oli 2,5 sekuntia.RFDR-spektreissä havaitut yksisidottuiset Cα/Cβ-korrelaatiot määritettiin DARR-spektrien tunnusomaisten jäännöstyyppisten kemiallisten siirtymien ja moninkertaisesti linkitettyjen korrelaatioiden perusteella.
Zipper79-tietokantaa (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) käytettiin NT:n, NTFlSp:n ja NTMiSp:n lepatustaipumusten ja Rosetta-energian arvioimiseen.Zipper-tietokanta laskee Rosetta Energy80:n, joka yhdistää useita vapaan energian funktioita proteiinirakenteen mallintamiseen ja analysointiin.Energiataso -23 kcal/mol tai alhaisempi osoittaa suurta fibrillaatiotaipumusta.Pienempi energia tarkoittaa kahden β-säikeen parempaa vakautta vetoketjun konformaatiossa.Lisäksi Waltz-algoritmia käytettiin amyloidogeenisten alueiden ennustamiseen NT:ssä, NTFlSp:ssä ja NTMiSp Ref:ssä.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT-proteiiniliuos sekoitettiin 2-(N-morfolino)etaanisulfonihappo (MES) -puskurin kanssa pH-arvoissa 5,5 ja 6,0 pH:n laskemiseksi pH-arvoon 6 ja 7, vastaavasti.Lopullinen proteiinipitoisuus oli 100 mg/ml.
Mittaukset suoritettiin J-1500 CD -spektrometrillä (JASCO, USA) käyttämällä 300 µl:n kyvettiä, jonka optinen reitti oli 0,1 cm.Proteiinit laimennettiin 10 µM:iin (n = 1) 20 mM fosfaattipuskuriin (pH 8).Proteiinin stabiilisuuden analysoimiseksi suolan läsnä ollessa proteiinit analysoitiin samassa pitoisuudessa (n = 1) 20 mM fosfaattipuskurissa (pH 8), joka sisälsi 154 mM NaF:a tai NaCl:a, vastaavasti.Lämpötilaskannaukset rekisteröitiin aallonpituudella 222 nm 25 °C:sta 95 °C:seen kuumennusnopeudella 1 °C/min.Natiivisti laskostuneiden proteiinien osuus laskettiin kaavalla (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Lisäksi jokaiselle näytteelle rekisteröitiin viisi spektriä 260 nm - 190 nm 25 °C:ssa ja 95 °C:seen kuumentamisen jälkeen.Viidestä spektristä laskettiin keskiarvo, tasoitettiin ja muutettiin molaariseksi elliptisiksi.Tiedot analysoitiin Prism 9:llä.
His-NT-GFP:n (300 mg/ml, 80 ui) fluoresenssin intensiteetti mitattiin kolmena rinnakkaisena (n = 3) 96-kuoppaisilla Corning-levyillä, joissa oli musta läpinäkyvä pohja (Corning Glass 3881, USA) staattisissa olosuhteissa.Mittaa näytteet fluoresenssipohjaisella levylukijalla, jonka viritysaallonpituus on 395 nm, ja kirjaa emissio aallonpituudella 509 nm ennen geeliytymistä ja 2 tuntia myöhemmin 37 °C:ssa.Tiedot analysoitiin Prism 9:llä.
Puriininukleosidifosforylaasin aktiivisuusmäärityspakkausta (fluorometrinen menetelmä, Sigma Aldrich) käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.Aktiivisuuden mittaamiseksi geeleissä ja liuoksissa, jotka sisältävät His-NT-PNP:tä, sekoita 10 ng His-NT-PNP:tä 100 mg/ml NT:n kanssa 2 µl:n kokonaistilavuuteen, koska geeli antoi signaalin, joka ylittää sarjan havaitsemisvälin.Kontrollit geeleille ja liuoksille ilman His-NT-PNP:tä sisällytettiin.Mittaukset suoritettiin kahdesti (n = 2).Kun aktiivisuus oli mitattu, reaktioseos poistettiin ja geeli valokuvattiin sen varmistamiseksi, että geeli pysyi ehjänä mittauksen aikana.Tiedot analysoitiin Prism 9:llä.
Lisätietoja tutkimussuunnittelusta on tähän artikkeliin linkitetyssä luontotutkimuksen tiivistelmässä.
Kuvat 1 ja 2 esittävät lähtötiedot.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f ja 6, lisäkuvat.3, lisäkuva fig.5a, d, lisäkuvio6 ja lisäkuvio8. Tiedot Tämän tutkimuksen tiedot ovat Zenodo-tietokannassa https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Tässä tutkimuksessa saadut NMR-tiedot lähetettiin BMRBig-tietovarastoon tunnuksella bmrbig36.GFP:n ja PNP:n rakenteet otettiin PDB:stä (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. ja Johansson, J. Spinning keinotekoinen hämähäkkisilkki.National Chemical.biologia.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et ai.Nephila clavipes -genomi korostaa hämähäkkisilkkigeenien monimuotoisuutta ja niiden monimutkaista ilmentymistä.National Genette.49, 895–903 (2017).