ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex hitsattu putki kemianteollisuudelle kemiallinen komponentti, SPECC1L:n puute johtaa silmukoitujen liitosten stabiiliuden lisääntymiseen ja kallon hermosolujen irtoamisen vähenemiseen.

Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käytät selainversiota, jossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 kaksipuolinen hitsattu putki kemianteollisuudelle

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.on johtava valmistaja , joka on erikoistunut ruostumattomasta teräksestä valmistettuihin saumattomiin putkiin , kirkkaasti hehkutettuihin putkiin , saumattomiin kierreputkiin jne.Asiakkaiden helpottamiseksi olemme myös hitsaneet putkia.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.on pisimmällä tuotanto - ja testauslaitteet .Voimme täysin tyydyttää vaatimuksesi .Erittäin tiukasti standardin mukaan valmistamillamme putkilla on aina oikea OD- ja WT-toleranssi.Toleranssi valvonta on tiukasti mukaisesti tuottaa standardeja .Tuotteemme ovat aina tyytyväisiä asiakkaisiin .Asiakkaat ostivat tuotteitamme loivat enemmän voittoja .
a) Ulkohalkaisija (ulkohalkaisija): 3,18–101,6 mm
b) WT (seinän paksuus): 0,5-20 mm
c) Pituus: Asiakkaan vaatimuksen mukaan
d) Standardit: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 jne
e) Prosessimenetelmä: ERW, EFW jne

Liukusäätimet, joissa näkyy kolme artikkelia per dia.Käytä Takaisin- ja Seuraava-painikkeita liikkuaksesi diojen välillä tai diaohjaimen painikkeita lopussa.
Kraniaaliset hermoharjasolut (CNCC) irtoavat alkion hermopoimuista ja siirtyvät nielun kaareihin, jotka muodostavat suurimman osan keskipinnan rakenteista.CNCC:n toimintahäiriöllä on tärkeä rooli suukasvojen halkeaman, joka on yleinen synnynnäinen epämuodostuma, etiologiassa.Heterotsygoottisia SPECC1L-mutaatioita on löydetty potilaista, joilla on epätyypillisiä ja syndroomisia halkeamia.Tässä raportoimme kanonisen liimaliitoksen (AJ) komponenttien, β-kateniinin ja E-kadheriinin parantuneen värjäytymisen viljellyissä SPECC1L-knockdown-soluissa, ja elektronimikrokuvat osoittavat AJ:n apikaali-tyvidiffuusiota.Ymmärtääksemme SPECC1L:n roolia kallon kasvojen morfogeneesissä loimme Specc1l-puutteisen hiirimallin.Homotsygoottiset mutantit ovat alkion tappavia, ja niillä on heikentynyt hermoputken sulkeutuminen ja CNCC-laminaatio.AJ-proteiinin värjäytyminen lisääntyy mutanttien hermolaskoksissa.Tämä AJ-virhe on yhdenmukainen CNCC-delaminaatiovirheen kanssa, joka vaatii AJ:n liukenemista.Lisäksi Specc11-mutantit ovat vähentäneet PI3K-AKT-signalointia ja lisänneet apoptoosia.In vitro PI3K-AKT-signaloinnin lievä esto villityypin soluissa oli riittävä indusoimaan AJ-muutoksia.Tärkeää on, että SPECC1L-knockdownin aiheuttamat AJ-muutokset voidaan kumota aktivoimalla PI3K-AKT-reitti.Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että SPECC1L, uusi PI3K-AKT-signaloinnin ja AJ-biologian säätelijä, tarvitaan hermoputken sulkemiseen ja CNCC-kerrostumiseen.
Kraniaaliset hermoharjasolut (CNCC:t) lokalisoituvat dorsaaliseen neuroektodermiin ja irtautuvat kehittyvien hermolaskosten neuroepiteelistä prosessin kautta, joka sisältää epiteeli-mesenkymaalisen siirtymän (EMT)1,2,3.Esivaeltavat epiteelin CNCC:t häiritsevät solujen välisiä liitoksia ja muuttuvat vaeltavista mesenkymaalisista CNCC:istä, jotka täyttävät ensimmäisen ja toisen nielun kaaren ja muodostavat suurimman osan kallonrustoa.Siten geenit, jotka säätelevät CNCC:n toimintaa, ovat usein häiriintyneet kallon ja kasvojen synnynnäisten poikkeavuuksien, kuten suu-kasvojen halkeamien, etiologiassa, jotka yleisimmin vaikuttavat 1/800 synnytykseen yksin Yhdysvalloissa.Yksi synnynnäisistä epämuodostumista8.
CNCC:n delaminaatio osuu samaan aikaan anteriorisen hermoputken sulkeutumisen kanssa 8,5–9,5 päivän alkionkehityksen aikana hiirillä.Useiden hiiren suu- ja kasvojen halkeamiin liittyvien geenien mutanteissa on myös jonkinlainen hermoputkivika, mukaan lukien Irf69, 10, Ghrl310, Cfl111 ja Pdgfrα12.Hermoputken sulkemisen ja CNCC:n kerrostumisen prosesseja voidaan kuitenkin pitää itsenäisinä, koska Splotch-mutanttihiirellä (Pax3) on puutteita hermoputken sulkeutumisessa ilman, että se vaikuta CNCC:n kerrostumiseen tai migraatioon 13,14.Muut hiirimallit, joissa on vikoja CNCC:n dissektiossa ja hermoputken sulkemisessa, auttavat määrittelemään näiden kahden prosessin yhteisen molekyyliperustan.
CNCC:n eristäminen neuroepiteelisoluista edellyttää adhesiivisten liitosten (AJ) liukenemista, jotka koostuvat proteiinikomplekseista, jotka sisältävät mm. E-kadheriinia, β-kateniinia, α-E-kateniinia ja α-aktiniinia, jotka liittyvät aktiinifilamentteihin 2 Yliekspressiotutkimukset E-kadheriini hermopoimuissa osoitti CNCC:n delaminaatiossa vähentymistä tai viivästymistä.Sitä vastoin E-kadheriinin suppressio johtaa varhaiseen kerrostumiseen15,16.Monet tekijät, jotka välittävät EMT:tä CNCC:n kerrostumisen aikana, ovat transkriptiotekijöitä (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) ja solunulkoisen matriisin (ECM) uudelleenmuotoiluproteiineja, kuten matriksin metalloproteinaaseja (MMP:t), mutta CNCC:t ovat suoria solun tukirangan AJ-säätelyaineita. ei vielä tiedossa.PI3K-AKT-reitin tiedetään antagonisoivan E-kadheriinitasoja, pääasiassa syöpätutkimuksesta17.Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että PDGFα-pohjaisen PI3K-AKT-signaloinnin menetys hiirillä johtaa kallon ja kasvojen poikkeavuuksiin, mukaan lukien suulakihalkeama ja hermoputkivauriot12.PI3K-AKT-reitin ja AJ-stabiilisuuden välinen suhde CNCC-kerrostuman yhteydessä on kuitenkin epäselvä.
Tunnisimme aiemmin SPECC1L:n ensimmäiseksi mutanttigeeniksi kahdessa ihmisessä, joilla on vakava rako, joka ulottuu suusta silmään, joka tunnetaan nimellä oblique cleft (ObFC) tai Tessier IV18 -halkio.SPECC1L-mutaatioita on tunnistettu kahdessa monen sukupolven perheessä, joilla oli autosomaalinen dominantti Opitz G/BBB -oireyhtymä (OMIM #145410), jossa sairastuneilla yksilöillä oli hyperetäisyys ja huuli-/suulakihalkio19, ja yhdessä perheessä, jossa oli tibi-ylietäisyysoireyhtymä (OMIM #145420)20. .yli puolet Opitz G/BBB -oireyhtymän tapauksista on X-kytketty (OMIM #300000) ja ne johtuvat mutaatioista MID1-geenissä, joka koodaa mikrotubuluksiin liittyvän solurungon proteiinia 22.Oletamme, että SPECC1L, myös proteiini, joka liittyy mikrotubuluksiin ja aktiinin sytoskeletoniin, voi välittää signalointia, jota tarvitaan aktiinin sytoskeleton uudelleenmuodostukseen soluadheesion ja migraation aikana18.In vitro- ja in vivo -tutkimusten avulla kuvaamme nyt SPECC1L:n uudeksi AJ-stabiiliuden säätelijäksi PI3K-AKT-signaloinnin kautta.Solutasolla SPECC1L-puutos johti pan-AKT-proteiinin tason laskuun ja AJ:n apikaal-perusdispersion kasvuun, mikä eliminoitui AKT-reitin kemiallisella aktivaatiolla.In vivo Spec11-puutteellisilla alkioilla on heikentynyt hermoputken sulkeutuminen ja vähentynyt CNCC-dissektio.Siten SPECC1L toimii erittäin säädellyssä soluadheesioon perustuvassa signaloinnissa, jota tarvitaan normaalille CNCC-toiminnalle kasvojen morfogeneesin aikana.
SPECC1L:n roolin karakterisoimiseksi solutasolla käytimme aiemmin kuvattua stabiilia osteosarkoomasolulinjaa U2OS, josta puuttui SPECC1L18.Näillä stabiileilla U2OS-soluilla, joilla oli SPECC1L (kd) knockdown, SPECC1L-transkriptien ja proteiinien tasot laskivat kohtalaisesti (60–70 %) sekä vikoja aktiinin sytoskeleton 18:n siirtymisessä ja uudelleenjärjestelyssä. SPECC1L:n on osoitettu johtavan mitoosivirheisiin 23 .Lisäkarakterisoinnin jälkeen havaitsimme, että stabiilit SPECC1L-kd-solumme muuttivat morfologiaa erittäin korkealla konfluenssiasteella (kuva 1).Yksittäiset kontrollisolut ja kd-solut matalassa konfluenssissa näyttivät samanlaisilta (kuvio 1A, D).24 tuntia fuusion jälkeen kontrollisolut säilyttivät kuutiomuotonsa (kuvio 1B, E), kun taas SPECC1L-kd-solut pitkittyivät (kuvio 1C, F).Tämän solumuodon muutoksen laajuus tallennettiin kontrollisolujen ja kd-solujen elävällä in vivo -kuvauksella (elokuva 1).SPECC1L:n roolin määrittämiseksi konfluenteissa soluissa tutkimme ensin sen ilmentymistä.Havaitsimme, että SPECC1L-proteiinitasot nousivat fuusiossa (kuvio 1G), kun taas SPECC1L-transkriptitasot eivät lisääntyneet (kuvio 1H).Lisäksi solutiheyden lisääntyessä SPECC1L-proteiini kerääntyi solujen välisille rajoille (kuvio 2A-E) kuvion ollessa päällekkäinen kalvoon liittyvän p-kateniinin kanssa (kuvio 2A'-E').Ottaen huomioon SPECC1L:n yhteyden aktiinin sytoskeleton 18, 23 kanssa oletimme, että SPECC1L on vuorovaikutuksessa aktiinipohjaisten liimaliitosten (AJ) kanssa.
(AF) SPECC1L knockdown (DF) -solut pidentyvät korkeassa konfluenssissa (F) verrattuna kontrolli-U2OS-soluihin (AC).Tässä näytetään kolme kuudesta aikapisteestä (T1, T3, T6), jotka valitsimme eri solutiheyksille.(G) Western blot -analyysi, joka osoittaa, että SPECC1L-proteiini on stabiloitunut korkeassa konfluenssiasteessa verrattuna alhaiseen konfluenssiasteeseen kontrollisoluissa.SPECC1L:n Western blot näyttää odotetun 120 kDa:n vyöhykkeen ja suuremman molekyylipainon vyöhykkeen, mahdollisesti translaation jälkeen modifioituna (*).Western blot -analyysi suoritettiin samoissa olosuhteissa matalalle ja korkealle konfluenssille.Samasta blotista otettiin kuvat, joissa näkyy SPECC1L matalassa ja korkeassa konfluenssissa.Sama blotti poistettiin ja tutkittiin uudelleen p-aktiinivasta-aineella.(H) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi ei osoittanut merkittäviä muutoksia SPECC1L-transkriptitasoissa.Virhepalkit edustavat SEM:itä neljästä riippumattomasta kokeesta.
(AE) Valitsimme kuusi aikapistettä (T1-T6), jotka edustavat solutiheysaluetta normalisoidaksemme solun muoto-analyysin ja AJ-muutokset U2OS-soluissa SPECC1L-knockdownilla (kd).Ensimmäiset viisi näistä aikapisteistä sisälsivät yksittäiset solut (T1), 50-70-prosenttisen pienten soluklustereiden fuusion (T2), fuusion ilman kd-solujen uudelleenmuotoilua (T3), kd-solujen uudelleenmuotoilua (T4) ja 24 tunnin muutokset.kd (T5) -solujen posteriorisessa muodossa.SPECC1L-proteiini oli pääasiassa dispergoituneena sytoplasmaan T1:ssä (A), mutta sen kertymistä havaittiin solujen välisillä rajoilla seuraavina ajankohtina (B-E, nuolet).(FJ) β-kateniini osoittaa samanlaista kertymistä AJ-kompleksiin liittyvillä solujen välisillä rajoilla.(A'-E') SPECC1L ja p-kateniini osoittavat päällekkäistä värjäytymistä solurajoilla korkealla solutiheydellä (nuolet).(F'-J') SPECC1L-kd-soluissa β-kateniinivärjäytyminen näyttää normaalilta alhaisella solutiheydellä (F'-H'), mutta laajenee solun muodon muuttuessa (I', J'; nuolet), mikä osoittaa, että AJ Ovat muuttuneet.Tangot = 10 µm.
Yritimme sitten määrittää SPECC1L-puutoksen vaikutuksen AJ:hen.Käytimme useita AJ:hen liittyviä markkereita, mukaan lukien kanoniset komponentit F-aktiini, myosiini IIb, β-kateniini ja E-kadheriini24,25,26,27.Aktiinin stressikuidut lisääntyivät SPECC1L-kd-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu (kuviot 3A, B)18.Myosiini IIb, joka liittyy aktiinifilamentteihin, osoitti samanlaista kasvua SPECC1L-kd-soluissa in vitro (kuvio 3C, D).AJ-assosioitunut β-kateniini sitoutuu kadheriiniin solukalvolla osoittaen normaalia "hunajakenno" ilmentymismallia kontrollikuubosyyteissä (kuvio 3E, G).Mielenkiintoista on, että litteissä kuvissa, joissa käytettiin konfokaalista mikroskopiaa, β-kateniinin (kuvat 3E, F) ja E-kadheriinin (kuvio 3G, H) värjäytyminen konfluenttien SPECC1L-puutteisten solujen solukalvolla osoitti näkyviä laajennetun värjäytymisen malleja.Tämä AJ:hen liittyvän p-kateniinivärjäytymisen laajeneminen kd-soluissa oli selkein yhtymäkohdassa, mutta näytti edeltävän solumuodon muutoksia (kuvio 2F-J, F'-J').Tämän laajennetun AJ-värjäyksen fyysisen luonteen määrittämiseksi tutkimme solurajoja SPECC1L-kd U2OS -solujen apikaali-tyvipinnalla transmissioelektronimikroskoopilla (TEM) (kuva 3I, J).Toisin kuin kontrollisoluissa (kuvio 31), joissa oli erilliset elektronitiheät alueet, jotka osoittivat AJ:tä (nuolet), kd-soluissa (kuvio 3J) oli suuria, vierekkäisiä alueita, joilla oli korkea elektronitiheys, mikä osoitti AJ:tä apikobasaalista tasoa pitkin..Lisäksi poikittaisleikkauksilla havaitsimme laajoja solukalvolaskoksia kd-soluissa (kuva S1A, B), mikä selittää β-kateniinin ja E-kadheriinin värjäysjuovien laajennetun kuvion (kuva 3F, H).SPECC1L:n roolin tueksi AJ:issä β-kateniini immunosaostettiin yhdessä SPECC1L:n kanssa konfluenttien U2OS-solujen lysaateissa (kuvio 3K).AJ-markkerien laajennetun immunovärjäyksen ohella TEM-analyysi oli yhdenmukainen hypoteesimme kanssa, jonka mukaan SPECC1L-puutos lisää AJ:n apikaali-tyvitiheyttä ja varianssia.
(AH) Lisääntynyt F-aktiinin värjäytyminen kd-soluissa 48 tuntia fuusion jälkeen (T6; A, B).F-aktiiniin liittyvä myosiini IIb:n muuttunut värjäys (C, D).P-kateniinin ja E-kadheriinin kalvovärjäytymisen tasainen kuvio kontrollisoluissa (E, G) vahvistui SPECC1L-kd (F, H) -soluissa.Tangot = 10 µm.(I–J) Elektronimikroskooppikuvat, jotka tarkkailevat apikaal-tyvisolujen välistä liitoskohtaa.Kontrollisoluissa on erilliset elektronitiheät alueet, jotka osoittavat tahmeita liitoksia (I, nuolet).Sitä vastoin koko apikaali-tyviliitos SPECC1L-kd-soluissa näytti elektronitiheältä (J, nuolet), mikä osoittaa liimaliitosten lisääntyneen tiheyden ja hajaantumisen.(K) P-kateniini yhteisimmunosaostettiin SPECC1L:n kanssa konfluenteissa U2OS-solulysaateissa.Yhdestä paikasta otettu kuva, joka edustaa yhtä neljästä riippumattomasta kokeesta.
Ymmärtääksemme SPECC1L:n roolin kallon kasvojen morfogeneesissä loimme Specc1l-puutteisen hiirimallin käyttämällä kahta riippumatonta ES trap -solulinjaa, DTM096 ja RRH048 (BayGenomics, CA), jotka edustavat intronia 1 ja Specc1l-transkriptit siepattiin 15:ssä (kuva 1). .4A, kuva S2).Syöttivektorin insertin genominen sijainti määritettiin koko genomin sekvensoinnilla ja vahvistettiin PCR:llä (kuva S2).Molemmat geeniloukkumallit mahdollistivat myös Specc11-lacZ-reportterien kehyksen sisäisen fuusion sieppauksen yhteydessä.Siksi X-gal-värjäyksellä määritettyä lacZ-ilmentymistä käytettiin Specc11-ekspression indikaattorina.Molemmat alleelit osoittivat samanlaisia ​​lacZ-ilmentymiskuvioita, ja DTM096-geeniloukku intronissa 1 osoitti voimakkaampaa ilmentymistä kuin RRH048 intronissa 15 (ei esitetty).Specc1l on kuitenkin laajalti ilmentynyt, ja sen ilmentyminen on erityisen voimakasta hermopoimuissa kohdassa E8.5 (kuva 4B), hermoputkessa ja kasvoprosesseissa kohdissa E9.5 ja E10.5 (kuvat 4C, D) ja kehittyvissä raajoissa. osoitteessa E10.5 ja silmät (kuva 4D).Ilmoitimme aiemmin, että SPECC1L:n ilmentyminen ensimmäisessä nielun kaaressa kohdassa E10.5 oli läsnä epiteelissä ja taustalla olevassa mesenkyymissa18, mikä on yhdenmukainen CNCC-linjan kanssa.SPECC1L:n ilmentymisen testaamiseksi CNCC:ssä suoritimme E8.5-hermopoimut (kuva 4E-J) ja E9.5-kalloleikkeitä (kuva 4K-).Kohdassa E8.5 SPECC1L värjäsi hermolaskoksia voimakkaasti (kuvio 4E, H), mukaan lukien solut, jotka oli värjätty NCC-markkereilla (kuvio 4G, J).Kohdassa E9.5 SPECC1L (kuvio 4K, N) värjäytyi voimakkaasti migroivaa CNCC:tä, joka värjäytyi yhdessä AP2A:n (kuvio 4L, M) tai SOX10:n (kuvio 40, P) kanssa.
(A) Kaavamainen esitys hiiren Specc11-geenistä, joka osoittaa houkutusvektorin insertion ES DTM096 (introni 1) ja RRH048 (introni 15) soluklooneihin.(BD) lacZ-värjäys heterotsygoottisista SpecclDTM096-alkioista, jotka edustavat Speccl-ekspressiota E8.5:stä E10.5:een.NE = neuroektoderma, NF = hermopoimu, PA1 = ensimmäinen nielun kaari.(EP) SPECC1L-immunovärjäys NCC-markkereilla AP2A ja SOX10 E8.5 (NF; EJ) hermopoimuissa ja E9.5 (KP) kalloleikkeissä.SPECC1L-värjäytymistä havaittiin laajalti hermolaskoksissa E8.5 (E, H; nuolenpäät), mukaan lukien solut, jotka oli leimattu AP2A:lla (F, G; nuolenpäät) ja SOX10:llä (I, J; nuolenpäät).E9.5:ssä SPECC1L värjäytyi voimakkaasti vaeltavia CNCC:itä (K, N; nuolet), jotka oli merkitty AP2A:ksi (L, M; nuolet) ja SOX10:ksi (O, P; nuolet).
Heterotsygoottisten Specc1lDTM096/+- ja Specc1lRRH048/+-hiirten välinen risteytys osoittaa, että kaksi geeniloukku-alleelia eivät ole komplementaarisia ja että yhdiste heterotsygootit ja alkion homotsygootit kummallekin geeniloukkualleelille ovat alkiolle tappavia (taulukko S1).Mendeliläiset suhteet osoittivat heterotsygoottien eloonjäämisasteen laskun syntymän jälkeen (odotettu 1,34 vs. 2,0).Huomasimme alhaisen perinataalisen kuolleisuuden heterotsygoottien keskuudessa, joillakin oli kallon kasvojen poikkeavuuksia (kuva S3).Näiden perinataalisten kallon kasvojen fenotyyppien alhainen penetranssi vaikeuttaa kuitenkin niiden taustalla olevien patofysiologisten mekanismien tutkimista.Siksi keskityimme homotsygoottisten Specc11-mutanttien alkion tappavaan fenotyyppiin.
Suurin osa heterotsygoottisista tai homotsygoottisista Specc1lDTM096/RRH048-mutanttialkioista ei kehittynyt E9.5–10.5:n jälkeen (kuvat 5A–D), ja hermoputki ei sulkeutunut edestä (kuvat 5B, D) ja joskus sulkeutunut takapuolelta (ei esitetty). ..Tämä kallon hermoputken sulkeutumisvika liittyi siihen, että suurin osa CNCC-merkitystä DLX2:sta jäi hermopoimuihin kohdassa E10.5, mikä osoitti, ettei dissektiota (kuvio 5A'-D').Sen määrittämiseksi, oliko myös CNCC:n kokonaiskoko pienentynyt, merkitsimme CNCC-linjat GFP:llä geeniloukkulinjoihimme Wnt1-Cre:llä ja ROSAmTmG:llä.Virtaamme kokonaisista alkioista lajiteltuja GFP+ NCC:itä ja GFP- (RFP+) ei-NCC:itä.E9.5:ssä virtauslajiteltujen GFP-leimattujen CNCC-solujen osuus ei muuttunut merkittävästi WT:n ja mutanttialkioiden välillä (ei esitetty), mikä viittaa normaaliin CNCC-spesifikaatioon.Siksi oletimme, että Wnt1-Cre- ja DLX2-jäännösvärjäytyminen paljastuneissa hermolaskoksissa (kuvio 5B') johtui viallisesta CNCC-kerroksesta, mahdollisesti johtuen AJ-solujen lisääntyneestä tiheydestä tai dispersiosta, kuten SPECC1L-kd-soluissa nähdään.Käytimme NCC-markkereita SOX10, AP2A ja DLX2 vahvistaaksemme CNCC:n läsnäolon hermolaskosessa (kuva 5E-R).Kohdassa E8.5 havaittiin hermolaskosten värjäytyminen kaikille kolmelle NCC-markkerille WT:n (kuvio 5E, G, I) ja Speccl-mutantin (kuvio 5F, H, J) osissa.Kohdassa E9.5, kun NCC-markkerit värjäsivät kulkevaa NCC:tä WT-leikkeissä (kuvio 5M, O, Q), jäljelle jäänyt NCC-värjäytyminen havaittiin Speccll-mutanttialkioiden paljastuneissa hermolaskoksissa (kuvio 5N, P, R).Koska SOX10 ja DLX2 merkitsevät siirtyviä CNCC:itä, tämä tulos viittaa siihen, että SPECC1L-puutteiset CNCC:t saavuttavat muuton jälkeisen spesifikaation, mutta eivät siirry hermolaskosta.
Specc11-puutos johtaa vialliseen hermoputken sulkeutumiseen, kallon hermonharjasolujen delaminaatioon ja AJ:ihin.
(A, B') E9.5 WT (A) Alkio, joka kantaa vaeltavia kallon hermonharjasoluja (CNCC), jotka on leimattu Wnt1-Cre:llä (A').Sitä vastoin Specc11-mutanttialkioissa on avoimia hermolaskoksia (B), nuolenpäät) ja CNCC:itä, jotka eivät ole siirtyneet (B', nuolenpäät).(C, D') E10.5 WT -alkioiden (C, C') ja Specc1l:n (D, D') CNCC-markkerin DLX2:n kirkkaat kenttäkuvat (C, D') ja immunovärjäys (C', D').WT E10.5 -alkioissa DLX2-positiivinen CNCC kolonisoi kiduskaaret (C', nuolet), kun taas mutanteissa näkyvä värjäytyminen säilyy avoimissa hermopoimuissa (D', nuolet) ja ensimmäisissä nielun kaarissa (D', nuolet).), jossa on joitakin värjäytymiä (nuolet), jotka osoittavat CNCC:n huonoa delaminaatiota ja migraatiota.ER) WT- ja Specc1l-mutanttialkioiden leikkeet vaiheissa E8.5 (E–L) ja E9.5 (M–R) leimattiin NCC-markkereilla SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) ja DLX2 (I, J, Q, R).E8.5:ssä NCC-värjäytyminen havaittiin villityypin hermolaskosteessa (NF) ja mutanttileikkeissä.SOX10:n ja β-kateniinin yhteisvärjäys E8.5 WT:ssä (K) ja mutantissa (L) paljasti lisääntyneen β-kateniinin värjäytymisen solurajoilla hermolaskoksissa.E9.5:ssä havaittiin vaeltavien CNCC:iden (M, O, Q) villityypin värjäytyminen, kun taas mutanteissa kerrostumattomat CNCC:t värjäsivät avoimia hermolaskoksia (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ -leimausanalyysi WT- ja Specc11DTM096/RRH048-alkioiden koronaalisissa leikkeissä, joissa on E9.5-mutaatio.Likimääräinen leikkaustaso näkyy oikeassa yläkulmassa.Mutanttikudosten osissa havaittiin F-aktiinin (S, T) ja myosiini IIb:n (U, V) lisääntynyttä värjäytymistä.Samalla tavalla kuin in vitro -tulokset kuviossa 3, mutanttialkioissa havaittiin tehostunut kalvovärjäytyminen p-kateniinille (W, X) ja E-kadheriinille (Y, Z).(AA-BB) Elektronimikroskooppikuva villityypin alkion osasta, joka katsoo apikaalisen tyvisolun rajan yli, osoittaa selkeän elektronitiheän alueen, joka osoittaa tarttuvia liitoksia (AA, nuolet).Sitä vastoin Specc11-mutanttialkioiden osissa (BB, nuolet) koko apikobasaalinen liitoskohta on elektronitiheä, mikä osoittaa liimaliitosten lisääntyneen tiheyden ja hajaantumisen.
Testaaksemme hypoteesiamme, että vähentynyt kerrostuminen johtuu muuttuneesta AJ:stä, tutkimme AJ-leimausta Specc1l-mutanttialkioiden paljaissa hermolaskoksissa (kuva 5S-Z).Havaitsimme aktiinin stressikuitujen lisääntymisen (kuvio 5S, T) ja samanaikaisesti myosiini IIB:n värjäytymisen lisääntyneen lokalisoitumisen aktiinikuituihin (kuvio 5U, V).Tärkeää on, että havaitsimme β-kateniinin (kuvio 5W, X) ja E-kadheriinin (kuvio 5Y, Z) lisääntynyttä värjäytymistä solujen välisillä rajoilla.Tutkimme myös NCC:n β-kateniinivärjäytymistä E8.5-alkioiden hermopoimuissa (kuvio 5K, L).β-kateniinivärjäytyminen näytti olevan voimakkaampi Specc1l-mutanttien hermopoimuissa (kuvat 5L ja K), mikä viittaa siihen, että AJ-muutokset olivat alkaneet.E9.5-alkioiden kallonosien elektronimikrovalokuvissa havaitsimme jälleen lisääntynyttä diffuusia elektronitiheää värjäytymistä Specc1l-mutanttialkioissa verrattuna WT:hen (kuvio 5AA, BB ja S1E-H).Yhdessä nämä tulokset tukevat in vitro -tuloksiamme SPECC1L-kd U2OS-soluissa ja viittaavat siihen, että poikkeava AJ-värjäys edeltää CNCC-kerrostumista mutanttialkioissamme.
Ottaen huomioon tunnetun antagonistisen suhteen AKT-aktiivisuuden ja E-kadheriinin stabiilisuuden välillä, 17, 28 oletimme PI3K-AKT-signaloinnin osallisuuden.Lisäksi havaitsimme subepidermaalisia rakkuloita joissakin mutanttialkioissamme, jotka pakenivat kuolleisuutta (<5 %) klo E9.5-10.5 ja sen sijaan asettuivat noin E13.5:een (kuva S3).Subepidermaaliset vesikkelit ovat PDGFRα12:een perustuvan vähentyneen PI3K-AKT-signaloinnin tunnusmerkki.Fantauzzo et ai.(2014) raportoivat, että PDGFRα-pohjaisen PI3K-aktivaation häiriintyminen PdgfraPI3K/PI3K-mutanttialkioissa johtaa subepidermaalisiin rakkuloihin, hermoputken vaurioihin ja suulakihalkiofenotyyppeihin.Pan-AKT:n ja aktiivisen fosforyloidun Ser473-AKT:n tasot todellakin vähenivät in vivo Speccll-mutanttikudoksista E9.5-alkionpysähdykseen (kuviot 6A-D).Fosforyloidun Ser473-AKT:n tasojen lasku voi johtua kokonaan pan-AKT-tasojen laskusta in vivo (kuvio 6E) ja in vitro (kuvio 6F).In vitro -lasku havaittiin vain, kun U2OS-solut olivat vahvasti konfluentteja solumuodon ja AJ-tiheyden muutosten kanssa (kuva 6D).Näin ollen tietomme viittaavat siihen, että SPECC1L on uusi positiivinen PI3K-AKT-signaloinnin säätelijä kallon kasvojen morfogeneesissä.
(A–E) E8.5 (A,B) ja E9.5 (C,D) kalloleikkeet tai E9.5-lysaatit Specc1l-mutanttialkioista (E), jotka osoittavat aktiivisen fosforyloidun S473-AKT:n ja pan-AKT-proteiinin vähenemisen , verrattuna kontrolli WT:hen.Western blot -analyysi suoritettiin villityypin lysaateille ja mutanttilysaateille samoissa olosuhteissa.SPECC1L:lle esitetyt kuvat otettiin yhdestä blotista.Sama blotti poistettiin ja tutkittiin uudelleen anti-pan-ACT- ja p-aktiinivasta-aineilla.Pan-AKT-tasot E8.5-hermopoimuissa (A, B) ja fosforyloidun S473-AKT:n tasot E9.5-kallon osissa vähenivät merkittävästi.(F) Pan-AKT-tasot alenivat samalla tavalla SPECC1L-kd U2OS-solujen lysaateissa, jotka oli kerätty korkeassa konfluenssissa.Virhepalkit edustavat SEM:itä kolmesta riippumattomasta Western blot -kvantifioinnista.(GJ) WT-alkioiden leikkeet kohdassa E9.5, jotka on värjätty KI67:llä ja pilkotulla kaspaasilla 3, vastaavasti, osoittaen solujen lisääntymistä (G, G') ja vähän apoptoottista aktiivisuutta (H, H').Specc11-mutanttialkioissa on vertailukelpoinen soluproliferaatio (I), mutta apoptoosin läpikäyvien solujen lukumäärä on merkittävästi lisääntynyt (J).
Sitten tutkimme proliferaation ja apoptoosin markkereita.Emme havainneet mitään eroa E9.5-alkioiden proliferaatiossa (kuvio 6E, G verrattuna I:hen), kun proliferaatioindeksi oli 82,5 % WT-mutanteille ja 86,5 % Specc1l-mutanteille mitattuna KI67-värjäyksellä (p <0,56, Fisherin alkio). tarkka testi).Samoin emme havainneet mitään eroa apoptoosissa mitattuna värjäytymällä pilkkoutuneelle kaspaasille 3 hermolaskoksissa E8.5:ssä alkionpysähdykseen asti (ei esitetty) (ei esitetty).Sitä vastoin apoptoosi lisääntyi merkittävästi kaikissa E9.5-mutanttialkioissa (kuvio 6F, H ja J).Tämä apoptoosin yleinen lisääntyminen on yhdenmukainen vähentyneen PI3K-AKT-signaloinnin ja varhaisen alkion kuolleisuuden kanssa29, 30, 31.
Seuraavaksi PI3K-AKT-signaloinnin syy-osuuden vahvistamiseksi kd-solujemme AJ-muutoksissa muutimme kemiallisesti reittiä kontrolli- ja kd-soluissa (kuvio 7A-F).Käytimme markkerina konfluenteissa SPECC1L-kd-soluissa havaittua solumuodon muutosfenotyyppiä, jonka kvantifioimme käyttämällä pisimmän ulottuvuuden (pituuden) suhdetta vastaavaan pystysuuntaiseen ulottuvuuteen (leveys).Suhteen 1 odotetaan olevan suhteellisen pyöreitä tai kuutiomuotoisia soluja (kuvio 7G).Solumuodon lisäksi vahvistimme myös β-kateniinivärjäyksen vaikutuksen AJ:hen (kuvio 7A'-F').PI3K-AKT-reitin esto wortmanniinia käyttämällä oli riittävä muuttamaan solun muotoa kontrollisoluissa (kuvio 7A, C) ja AJ (kuvio 7A').PI3K-AKT-aktivaattori SC-79 ei vaikuttanut solun muotoon (kuvio 7A, E) tai AJ:n laajenemiseen (kuvio 7A') kontrollisoluissa.SPECC1L-kd-soluissa PI3K-AKT-reitin lisäsuppressio johti lisääntyneeseen apoptoosiin (kuviot 7B, D) ja p-kateniinivärjäytymisen huomattavaan lisääntymiseen (kuvio 7B'), mikä on yhdenmukainen raskaiden in vivo -mutanttiemme kanssa.Tärkeää on, että PI3K-AKT-reitin aktivointi paransi merkittävästi solun muotoa (kuvio 7B, F) ja AJ-fenotyyppejä (kuvio 7B).Solumuodon muutokset kvantifioitiin solun pyöreyssuhteena (CCR) ja niitä verrattiin merkitsevyyden suhteen edellä kuvatulla tavalla (kuvio 7G).Itse asiassa kontrollisoluissa (kuvio 7G, CCR = 1,56) wortmanniinikäsittely riitti muuttamaan merkittävästi solun muotoa (kuvio 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) samassa määrin kuin havaittiin. SPECC1L:ssä.-kd-solut (kuvio 7G, CCR = 3,46).SPECC1L-kd-solujen wortmanniinikäsittely (kuvio 7G, CCR = 3,60, merkityksetön) ei ollut merkitsevämpi kuin käsittelemättömät kd-solut (kuvio 7G, CCR = 3,46, merkityksetön) tai wortmanniinilla käsitellyt kontrollisolut (kuvio 7G)., CCR = 3,46, merkityksetön) vaikuttaa lisäksi solun pidentymiseen (7G, CCR = 3,61, merkityksetön).Mikä tärkeintä, SC-79 AKT -aktivaattori palautti SPECC1L-kd-solujen pitkänomaisen fenotyypin (kuvio 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Nämä tulokset vahvistavat, että SPECC1L säätelee PI3K-AKT-signalointia ja viittaa siihen, että SPECC1L:n kohtalainen lasku vaikuttaa soluadheesioon, kun taas voimakas lasku johtaa apoptoosiin (kuvio 8).
(A–F') Kontrolli (A, C, E) ja SPECC1L-kd (B, D, F) solut käsitelty PI3K-AKT-reitin estäjillä wortmanniinilla (C, D) tai SC-79 aktivaattorilla (E, F) Hoito Käsittelemättömät kontrollisolut ovat kuutiomuotoisia (A) normaalilla p-kissa-soluvärjäytyksellä (A'), kun taas kd-solut ovat pitkänomaisia ​​(B), joissa on lisääntynyt p-kissa-värjäytyminen (B').PI3K-AKT-reitin tukahduttamisen jälkeen kontrollisolut pidentyivät (C) β-cat-laajennuksella (C'), kun taas kd-solut alkoivat käydä läpi apoptoosia (D), samankaltaisia ​​kuin erittäin mutatoidut alkiot ja osoittavat erittäin parantunutta β-kissaa.värjäys (D').PI3K-AKT-reitin aktivoinnin jälkeen kontrollisolut pysyivät kuutiomaisina (E) ja niillä oli normaali β-cat (E') -värjäys, kun taas kd-soluilla oli merkittävästi parantunut solumuoto (F) ja β-cat (F') -värjäytyminen, mikä osoittaa (G) Solun muodon muutoksen aste (AF) kvantifioitiin käyttämällä pisimmän ulottuvuuden (pituus) solun pyöreyssuhdetta (CCR) ja vastaavaa pystysuuntaista ulottuvuutta (leveys) MetaMorph-ohjelmistolla.Käsittelemättömät (NT) SPECC1L-kd-solut (CCR = 3,46) olivat merkittävästi pidempiä kuin kontrollisolut (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Wortin PI3K-AKT-reitin esto kontrollisoluissa oli riittävä aiheuttamaan samanlaisen pidentymisen solumuodossa (CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9).Samoin AKT-aktivaatio SC-79:llä SPECC1L-kd-soluissa palautti solujen pidentymisen kontrollitasoille (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).SPECC1L-kd-solujen wortmanniinikäsittely johti lisääntyneeseen apoptoosiin, mutta ei lisää kasvua solumuodon muutoksessa (CCR=3,60) verrattuna käsittelemättömiin kd-soluihin (CCR=3,46, ns) tai wortmanniinilla käsiteltyihin kontrollisoluihin (3,61), joita havaittiin vuonna .ns = ei väliä.+/- SEM-mittaukset 50 solulle esitetään.Tilastolliset erot laskettiin Studentin t-testillä.
(A) Kaavamainen esitys PI3K-AKT-reitin estämisestä ja aktivoinnista, mikä johtaa AJ-muutoksiin ja vastaavasti pelastumiseen.(B) Ehdotettu malli AKT-proteiinin stabilointiin SPECC1L:llä.
Esivaeltavat CNCC:t vaativat AJ-lyysin erottaakseen etummaisista hermolaskosta neuroepiteelisoluista1,15,32.AJ-komponenttien lisääntynyt värjäytyminen ja apikaalisen perus-AJ:n epäsymmetrisen jakauman menetys SPECC1L-puutteellisissa soluissa sekä in vitro että in vivo yhdistettynä SPECC1L:n fyysiseen läheisyyteen β-kateniiniin viittaavat siihen, että SPECC1L toimii AJ:n paikallisen stabiilisuuden ylläpitämiseksi oikein organisaation lihakset.aktiinin sytoskeleton.SPECC1L:n assosiaatio aktiinin sytoskeleton ja β-kateniinin kanssa ja kondensoituneiden aktiinifilamenttien lukumäärän kasvu SPECC1L:n puuttuessa on yhdenmukainen havaitun AJ-tiheyden lisääntymisen kanssa.Toinen mahdollisuus on, että lisääntynyt aktiinikuitujen määrä SPECC1L-puutteellisissa soluissa johtaa muutokseen solujen välisessä jännityksessä.Koska solun stressi vaikuttaa AJ 33 dynamiikkaan, jännitteen muutokset voivat johtaa diffuusisempaan AJ 34:ään.Joten kaikki muutokset vaikuttavat CNCC-tasoihin.
Wnt1 ilmentyy varhaisissa hermolaskoksissa, jotka synnyttävät hermoharjasoluja.Siten Wnt1-cre linjan jäljitys merkitsee sekä ennen että siirtyvän NCC35:n.Wnt1 merkitsee kuitenkin myös selän aivokudoksen klooneja, jotka ovat myös peräisin varhaisista hermopoimuista 35, 36 , mikä tekee todennäköiseksi, että E9.5-mutanttien värjäys Wnt1-markkereille avoimissa hermopoimuissa ei ole CNCC.Positiivinen värjäyksemme NCC-markkereille AP2A ja SOX10 vahvisti, että Specc11-mutanttialkioiden paljastuneet hermolaskokset sisälsivät todellakin CNCC:tä.Lisäksi, koska AP2A ja SOX10 ovat varhaisen vaeltavan NCC:n markkereita, positiivinen värjäys osoitti, että nämä solut ovat vaeltamisen jälkeisiä CNCC:itä, joita ei voida stratifioida E9.5:llä.
Tietomme viittaavat siihen, että SPECC1L:n AJ:n molekyylisäätelyä välittää PI3K-AKT-signalointi.AKT-signalointi vähenee SPECC1L-puutteellisissa soluissa ja kudoksissa.Fantauzzon et al. havainnot.tukevat PI3K-AKT-signaloinnin suoraa roolia kallon kasvojen morfogeneesissä.(2014) osoitti, että PDGFRα-pohjaisen PI3K-AKT-signaloinnin aktivoinnin puute johtaa suulakihalkeamaan fenotyyppiin.Osoitamme myös, että PI3K-AKT-reitin esto riittää muuttamaan AJ:tä ja solumuotoa U2OS-soluissa.Havaintoidemme mukaisesti Cain et al.37 osoitti, että PI3K α110-alayksikön vaimennus endoteelisoluissa johtaa samanlaiseen lisääntymiseen solujen β-kateniinivärjäytymisessä, jota kutsutaan "yhteysindeksin" kasvuksi.Kuitenkin endoteelisoluissa, joiden aktiinifilamentit ovat jo hyvin organisoituneita, PI3K-AKT-reitin suppressio johtaa löysään solumuotoon.Sitä vastoin SPECC1L-kd U2OS -soluilla oli pitkänomainen solumuoto.Tämä ero voi olla solutyyppispesifistä.Vaikka PI3K-AKT-signaloinnin tukahduttaminen vaikuttaa pysyvästi aktiinin sytoskeletoniin, vaikutus solun muotoon määräytyy jännitteen muutoksilla, jotka johtuvat keskeisten aktiinikuitujen tiheyden ja organisoinnin muutoksista.U2OS-soluissa käytimme vain solun muodon muutoksia SPECC1L-puutteisen AJ-muutoksen ja palautumisen merkkinä.Yhteenvetona oletamme, että AKT-reitin estäminen SPECC1L-puutteessa lisää AJ-stabiilisuutta ja vähentää delaminaatiota CNCC:ssä.
Mielenkiintoista on, että pan-AKT-tasot alenivat in vitro ja in vivo fosforyloitujen 473-AKT-tasojen lisäksi SPECC1L:n puuttuessa, mikä viittaa PI3K-AKT-signaloinnin säätelyyn AKT-proteiinin stabiilisuuden tai vaihtuvuuden tasolla.SPECC1L- ja MID1-geenit, jotka molemmat liittyvät Opitz/GBBB-oireyhtymään, koodaavat proteiineja, jotka stabiloivat mikrotubuluksia18,22.Mekanismia, jolla SPECC1L ja MID1 välittävät mikrotubulusten stabiloitumista, ei täysin ymmärretä.SPECC1L:n tapauksessa tämä stabilointi sisältää mikrotubulusten osan tehostetun asetyloinnin18.On mahdollista, että SPECC1L käyttää samanlaista mekanismia muiden proteiinien, kuten AKT:n, stabiloimiseen.On osoitettu, että lysiinitähteiden asetylaatio AKT-proteiinissa johtaa kalvon lokalisoitumisen ja fosforylaation vähenemiseen38.Lisäksi K63-ketjun ubikvitinointi samassa lysiinitähteessä AKT:ssa vaaditaan sen kalvon lokalisoimiseksi ja aktivoimiseksi39, 40.Useista tekijöistä, jotka ovat vuorovaikutuksessa SPECC1L-proteiinien kanssa, jotka on tunnistettu erilaisissa korkean suorituskyvyn hiivan kaksihybridiseuloissa, neljä – CCDC841, ECM2942, APC ja UBE2I43 – ovat vaikuttaneet proteiinien kiertoon tai stabiilisuuteen ubikvitinaation tai sumoylaation kautta.SPECC1L voi olla mukana AKT-lysiinitähteiden translaation jälkeisessä modifikaatiossa, mikä vaikuttaa AKT:n stabiilisuuteen.SPECC1L:n kriittinen rooli AKT-proteiinin lokalisoinnissa ja stabiilisuudessa on kuitenkin vielä selvitettävä.
Vakavat viat SPECC1L:n ilmentymisessä in vivo johtivat lisääntyneeseen AJ-markkerin värjäytymiseen ja vialliseen CNCC-päällekkäisyyteen sekä lisääntyneeseen apoptoosiin ja varhaiseen alkion kuolleisuuteen.Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että hiiren mutantit, joilla on lisääntynyt apoptoosi, liittyvät hermoputken vaurioihin 44, 45, 46, 47 ja kallon kasvovaurioihin48.On ehdotettu, että liiallinen solukuolema hermolaskoksissa tai nielukaareissa voi johtaa riittämättömään solumäärään, jota tarvitaan asianmukaiseen morfogeneettiseen liikkeeseen 48, 49, 50.Sitä vastoin SPECC1L-puutteiset solulinjamme, joilla oli kohtalaisen alentunut SPECC1L-ekspressio, osoittivat vain AJ-muutoksia ilman todisteita lisääntyneestä solukuolemasta.Kuitenkin PI3K-AKT-reitin kemiallinen esto näissä Kd-soluissa johti lisääntyneeseen apoptoosiin.Siten SPECC1L:n ilmentymisen tai toiminnan kohtalainen väheneminen varmistaa solujen eloonjäämisen.Tämä on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että harvinaiset Specc11-mutanttialkiot, jotka pakenevat pidätyksestä st.E9.5 - ehkä heikentyneen geeninsieppaustehokkuuden vuoksi - pystyvät sulkemaan hermoputkinsa ja pysähtymään myöhemmin kehityksessään, usein kallon kasvojen vioista (kuva S3).Tämän kanssa on myös yhdenmukainen heterotsygoottisten Specc1l-alkioiden harvinainen esiintyminen kallon kasvojen poikkeavuuksilla – luultavasti lisääntyneen geeninsieppaustehokkuuden vuoksi – sekä löydös seeprakaloissa, joissa toinen SPECC1L-ortologista (specc1lb) aiheuttaa myöhäisiä alkion fenotyyppejä, mukaan lukien alaleuat ja molemminpuoliset halkeamat51.Siten ihmispotilailla tunnistetut heterotsygoottiset SPECC1L-funktion menettämismutaatiot voivat aiheuttaa pieniä häiriöitä SPECC1L:n toiminnassa kallon ja kasvojen morfogeneesin aikana, mikä riittää selittämään niiden orofakiaaliset halkeamat.SPECC1L-pohjainen solujen välisten kontaktien säätely voi myös olla osansa palatogeneesissä ja nielun kaarien fuusiossa.SPECC1L:n toiminnan lisätutkimukset auttavat selvittämään tilapäisten solujen välisten kontaktien roolia CNCC:ssä hermoputken sulkemisen aikana neuroepiteelisolujen liikkuvuudessa ja kallon kasvojen morfogeneesissä.
U2OS-osteosarkooman kontrolli- ja SPECC1L-kd-solut on kuvattu aiemmin (Saadi et al., 2011).SPECC1L:n vasta-aineita on myös karakterisoitu aiemmin (Saadi et al., 2011).Anti-β-kateniinivasta-aineet (kani; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (hiiri; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosiini IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-kadheriini (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornia), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pilkottu kaspaasi 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ja β-aktiini (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) käytettiin kuvatulla tavalla..Aktiinifilamentit värjättiin Acti-värjäytyneellä rodamiinifalloidiinilla (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS-kontrollisoluja ja SPECC1L-kd-soluja viljeltiin tavanomaisessa korkean glukoosipitoisuuden DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10 %:lla naudan sikiön seerumia (Life Technologies, Carlsbad, CA).AJ-muutoksia varten 2 x 105 solua kylvettiin lasille, joka oli käsitelty 0,1-prosenttisella sian gelatiinilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja tarkkailtiin solumuodon muutoksia.Solut kerättiin eri ilmoitettuina ajankohtina: 4 tuntia ymppäyksen jälkeen (t = 1), 24 tuntia ymppäyksen jälkeen (t = 2), yhtymäkohta ilman solumuodon muutosta (t = 3), solumuodon muutos (t = 4) , 24 tuntia solun muodon muutoksen jälkeen (t = 5) ja 48 tuntia solun muodon muutoksen jälkeen (t = 6) (kuvio 1, 2, 3).PI3K-AKT-reitin moduloimiseksi soluja viljeltiin osoitetuissa pitoisuuksissa PI3K-AKT-inhibiittori wortmanniinin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) tai SC-79-aktivaattorin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota) kanssa.Kemikaaleja sisältävä väliaine vaihdettiin päivittäin.
Kuva kehykseltä tallennettiin eläville kontrolli- ja KD-soluille normaaleissa viljelyolosuhteissa, ja vaihekontrastikuvia kerättiin 10 minuutin välein 7 päivän ajan.Kuvat hankittiin tietokoneohjatulla Leica DM IRB -käänteismikroskoopilla, joka oli varustettu mekaanisella alustalla ja 10 × N-PLAN -objektiivilla, joka on kytketty QImaging Retiga-SRV -kameraan.Kuvauksen aikana soluviljelmiä pidettiin 37 °C:ssa kosteassa ilmakehässä, jossa oli 5 % C02:ta.
Kahta geeniloukku-ES-solulinjaa DTM096 ja RRH048 Regional Mutant Mouse Resource Centeristä (UC Davis, CA) käytettiin luomaan Spec11-puutteellisia hiirilinjoja, joille nimettiin Specc1lgtDTM096 ja Specc1lgtRRH046.Lyhyesti, 129/REJ ES -soluja injektoitiin C57BL6-blastokysteihin.Tuloksena saadut kimeeriset uroshiiret jalostettiin naaraspuolisten C57BL6-hiirten kanssa jälkeläisten tunnistamiseksi, joilla oli agouti-turkin väri.Geeniloukkuvektoriinsertien läsnäoloa käytettiin heterotsygoottien tunnistamiseen.Hiiriä pidettiin sekataustalla 129/REJ; C57BL6.Geneettisen ansavektorin insertiokohdan sijainti varmistettiin RT-PCR:llä, genomin sekvensoinnilla ja geneettisellä komplementaatiolla (täydentävä kuva 1).Kaksinkertaisten heterotsygoottisten Specc1lGT-hiirten CNCC-linjan jäljittämiseksi ROSAmTmG (#007576) ja Wnt1-Cre (#003829) hiiret (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) risteytettiin ROSAmTmG- ja Wnt1-Cre-mutaatioalleelin tuottamiseksi Speccosl-embolissa.Kaikki kokeet hiirillä suoritettiin Kansasin yliopiston lääketieteellisen keskuksen Institutional Animal Care and Use Committeen hyväksymien protokollien mukaisesti.
Alkiot kiinnitettiin (1 % formaldehydiä, 0,2 % glutaraldehydiä, 2 mM MgCl2, 0,02 % NP-40, 5 mM EGTA) 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.Kiinnityksen jälkeen X-gal-värjäysliuoksessa (5 mM kaliumferrisyanidia, 5 mM kaliumferrisyanidia, 2 mM MgCl2:a, 0,01 % natriumdeoksikolaattia, 0,02 % NP-40:tä, 1 mg/ml X-gal) Tahrojen kehitys suoritettiin 37 °C:ssa .°C 1-6 tunnin kuluessa.Alkiot jälkifiksoitiin 4 % PFA:ssa ja visualisoitiin.
Western blottausta varten solut lyysattiin passiivisessa lyysipuskurissa (Promega, Fitchburg, WI), jota oli täydennetty HALT-proteaasi-inhibiittoreiden seoksella (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysaatit käsiteltiin 12-prosenttisilla polyakryyliamidi Mini-PROTEAN TGX -valmiilla geeleillä (Bio-Rad, Hercules, CA) ja siirrettiin Immobilon PVDF -kalvoille (EMD Millipore, Billerica, MA).Kalvot blokattiin 5 % maidossa PBS:ssä, joka sisälsi 0,1 % Tweenia.Vasta-aineita inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa tai yksi tunti huoneenlämpötilassa.Femto SuperSignal West ECL-reagenssia (Thermo Scientific, Waltham, MA) käytettiin signaalin luomiseen.Immunovärjäystä varten alkiot kiinnitettiin yön yli 4 % PFA/PBS:ssä ja kylmäsäilytettiin.Kudoksen kryosektiot blokattiin PBS:ssä, joka sisälsi 1 % normaalia vuohen seerumia (Thermo Scientific, Waltham, MA) ja 0,1 % Triton X-100:aa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ja sitten inkuboitiin 4 °C:ssa inkubaattorissa yö.anti-vasta-aineella ja fluoresoivalla sekundaarisella vasta-aineella (1:1000) 1 tunnin ajan 4 °C:ssa.Värjättyjä leikkeitä asetettiin ProLong-kultaväliaineeseen (Thermo Scientific, Waltham MA) ja tasaiset kuvat saatiin käyttämällä Leica TCS SPE konfokaalimikroskooppia.Jokainen immunovärjäys suoritettiin kolmena riippumattomana kokeena vähintään kahden mutanttialkion leikkausleikkeillä.Esitetään edustava koe.
Soluja inkuboitiin modifioidussa RIPA-puskurissa (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 % NP-40, 130 mM NaCl, 10 % glyseroli, 2 mM EDTA ja HALT-proteaasi-inhibiittori (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Lysaatit esipuhdistettiin G-proteiinin magneettihelmillä (Life Technologies, Carlsbad, CA) ja inkuboitiin sitten yön yli 4 °C:ssa anti-SPECC1L- tai IgG-proteiini-G-proteiinihelmien kanssa, joita käytettiin SPECC1L:n uuttamiseen ja Western blot -analyysi suoritettiin käyttämällä anti-SPECC1L-proteiinia. Yllä kuvattu -p-kateniinivasta-aine Esitetyt ko-IP-kokeet edustavat neljää riippumatonta koetta.
Kiinteät viljellyt solut tai hiiren alkion kudokset toimitettiin Kansasin yliopiston lääketieteellisen keskuksen elektronimikroskopiakeskukseen.Lyhyesti sanottuna näytteet upotettiin EMbed 812 -hartsiin (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymeroitiin yön yli 60 °C:ssa ja leikattiin 80 nm:ssä käyttämällä Leica UC7 -ultramikrotomia, joka oli varustettu timanttiterällä.Leikkeet visualisoitiin käyttämällä JEOL JEM-1400 transmissioelektronimikroskooppia, joka oli varustettu 100 kV Lab6-pistoolilla.
Kuinka lainata tätä artikkelia: Wilson, NR et al.SPECC1L:n puute johtaa silmukoituneiden liitosten vakauden lisääntymiseen ja kallon hermosolujen vähentyneeseen delaminaatioon.Tiede.6, 17735;doi: 10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Hermoharjan induktio ja erilaistuminen.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et ai.Kraniaaliset hermosolut liikkeessä: niiden rooli kallon kasvojen kehityksessä.American Journal of Medical Genetics.Osa A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: sen kasvu ja kehitys yli 20 vuoden ajan.Lastenlääkäri.patologia.laboratorio.lääke.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU ja Noten MM Läpimurto suufakiaalisten halkeamien genetiikassa.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. ja Riley, FM Molekulaariset mekanismit kallon hermosolujen vaeltamisen ja kuvioinnin aikana craniofacial kehitystä.Development 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH ja Murray, JK. Huuli- ja kitalakihalkio: geneettisten ja ympäristövaikutusten ymmärtäminen.luonnollinen kommentti.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et ai.Ihon, raajojen ja kallon kasvojen alueen epänormaali morfogeneesi interferonia säätelevillä tekijä-6:n (Irf6) puutteellisilla hiirillä.National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et ai.GRHL3:n hallitsevat mutaatiot aiheuttavat van der Waordin oireyhtymän ja heikentävät suun peridermin kehitystä.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ ja Juriloff, DM Päivitä luettelo hiiren mutanteista, joilla on puutteita hermoputken sulkeutumisessa, ja etene kohti täydellistä hermoputken sulkemisen geneettistä ymmärtämistä.Synnynnäisten epämuodostumien tutkiminen.Osa A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-välitteinen PDGFRalpha-signalointi säätelee eloonjäämistä ja lisääntymistä luuston kehityksessä p53-riippuvaisen intrasellulaarisen reitin kautta.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND ja Murdoch, JN Disheveled: Konvergentin laajenemisen suhde hermoputken sulkemiseen.Neurologian suuntaukset.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).