Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käytät selainversiota, jossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Liukusäätimet, joissa näkyy kolme artikkelia per dia.Käytä Takaisin- ja Seuraava-painikkeita liikkuaksesi diojen välillä tai diaohjaimen painikkeita lopussa.

Tuotteen Kuvaus

Ruostumattomasta teräksestä valmistetut 347L kelaputket, teräslaatu: SS347L

Ennen adaptiivisen immuunivasteen alkamista isännän luontainen puolustusjärjestelmä antaa antimikrobisen vasteen, jota välittää erittyneiden alfa-kiertoisten sytokiinien perhe, jota kutsutaan interferoniksi (IFNS).Tyypin I IFN -luokat IFNa ja IFNp aktivoivat soluvasteet, mukaan lukien viruksenvastaiset, proapoptoottiset, tulehdukselliset ja antiproliferatiiviset tilat.Ihmisillä tunnetaan 13 IFNa-alatyyppiä, jotka kaikki ovat ryhmittyneet kromosomiin 91. Yllättäen vain IFNa2:ta on tutkittu kliiniseen käyttöön.Viime aikoina on kiinnitetty erityistä huomiota muiden IFNa-alatyyppien tutkimukseen.Äskettäinen tutkimus osoitti, että IFNa14 on yksi tehokkaimmista isomuodoista HBV2: n ja HIV-13,4: n replikaation rajoittamisessa verrattuna kanoniseen IFNa2-alatyyppiin.

ISG:t muodostavat synnynnäisen immuunijärjestelmän selkärangan, erityisesti vasteena virushyökkäykselle.Ensimmäisenä puolustuslinjana virusinfektiota vastaan, solut käyttävät nopeasti soluproteiinien laajoja vuorovaikutuksia, joilla on laaja valikoima biologisia aktiivisuuksia.Näitä proteiineja ovat kuvion tunnistusreseptorit, signalointimolekyylit, transkriptiotekijät ja proteiinit, joilla on suorat viruksenvastaiset toiminnot, samoin kuin immuunivasteiden negatiiviset säätelijät9.Suuri osa ISG -aktiivisuuden tiedoista tulee funktionaalisista näytöistä, joissa käytetään yliekspressio -seulontaa10,11 tai geenien vaimennustekniikoita (siRNA, RNAi ja CRISPR) 12,13, joissa yksittäiset ISG: t ekspressoivat tai estetään ja niiden aktiivisuus testataan eri viruksilla.Vaikka nämä tutkimukset ovat määrittäneet yksittäisten ISG: ien viruksenvastaiset ominaisuudet, kunkin ISG: n taustalla olevat molekyylimekanismit ovat suurelta osin tuntemattomia.On yleisesti hyväksyttyä, että monet proteiinit ovat vuorovaikutuksessa yhden tai useamman sytokiinin kanssa täydellisen aktiivisuuden varmistamiseksi, joten joko ISG: t ovat suoraan vuorovaikutuksessa tai niiden vuorovaikutuksia välittävät soluproteiinit.Esimerkiksi äskettäinen fotocrossled Proteomics -tutkimus tunnisti ATPaasi VCP/P97: n tärkeimmäksi IFITM3 -vuorovaikutuskumppaniksi, jonka estäminen johtaa IFITM3: n lysosomaalisessa lajittelussa, liikevaihdossa ja Cotransport -urheilussa viruspartikkeleilla 14.Immunosaostukseen käyttämällä tunnistimme VAPA: n, vesikkeliin liittyvän proteiinin, vuorovaikutuskumppanina IFITM1/2/3: n kanssa, joka välittää kolesterolivälitteistä viruskypsytystä, ja tämä vahvistettiin toisella tutkimuksella käyttämällä hiivan kaksihybridijärjestelmää.Tieteellinen tuki 15 , 16 .
T-solut tunnistavat ja tuhoavat nämä patogeenit ja solut, joissa on kasvainspesifinen antigeeni.Tämän seurauksena patogeenit ja kasvainsolut usein tukahduttavat antigeenin esittelyprosessia immuunivalvonnan välttämiseksi.Lisäksi MHC-I:n säätely on heikentynyt 40–90 %:ssa ihmisen kasvaimista, ja siihen liittyy usein huonompi ennuste19.
Geenien, jotka osallistuvat taudinaiheuttajiin reagoimiseen, on vaihdettava nopeasti lepotilan ja aktiivisen transkription tilan välillä.Siksi useiden soluproteiinien oletetaan osallistuvan vasteeseen korkean IFN: n kysynnän ajan lyhyen ajanjakson ajan, mukaan lukien promoottorikromatiinin 20,21 uudistaminen ja modifiointi.Useimmat tutkimukset ovat keskittyneet yksittäisten ISG-proteiinipartnerien tunnistamiseen IFN:n läsnä ollessa.Useat proteomiset ja transkriptomiset tutkimukset mallisolujärjestelmissä ovat selventäneet IFN:n vaikutusta solumaisemaan.
Näiden kysymysten ratkaisemiseksi toteutimme disukkinimidi-suberaattivälitteisen kemiallisen silloittamisen (DSS) yhdistettynä massaspektrometriaan (CLMS) IFNa: n indusoiman proteiini-vuorovaikutusverkon ja sen dynamiikan tutkimiseksi.DSS lisää kovalenttisia sidoksia proteiinien proksimaalisten tähteiden ja/tai proteiinikompleksien välille in vivo.Seuraava MS -analyysi paljastaa spesifiset silloituskohdat, jotka heijastavat tietyn proteiinin alueiden alueellista läheisyyttä, jota kutsutaan sisäisiksi sidoksiksi tai alayksiköiksi proteiinikomplekseissa, joita kutsutaan keskinäisiksi suhteiksi.Tätä lähestymistapaa käyttämällä olemme tunnistaneet useita uusia proteiini-proteiinikomplekseja sekä interferonin aiheuttamia moniproteiinivuorovaikutusverkostoja.Testaamalla lisätietoja näistä uusista vuorovaikutuksista osoitamme, että H2BF: t (H2B-histonityyppinen FS; jäljempänä nimellä H2B) ja MDN1 toimivat HLA-A: n sitoutumiskumppaneina.
Flo-1-solut ovat yksi tunnetuimmista ruokatorven adenokarsinooman in vitro -malleista, koska ne jäljittelevät ruokatorven kasvainten keskeisiä piirteitä22,23.
(A) Proteiiniekspressio FLE-1-soluissa, joita käsiteltiin 10 ng/ml IFNa: lla 2, 6, 24, 48 ja 72 tunnin ajan, immunoblotilla analysoitiin osoitettuja ISG-vasta-aineita käyttämällä.
IN situ -proteiinien vuorovaikutusmaiseman kaappaamiseksi käytimme DSS: ää, laajalti käytettyä silloittumista aihetta sen korkean kalvon läpäisevyyden ja suhteellisen lyhyen reaktioajan vuoksi.Lyhyempi reaktioaika auttaa estämään silloittujen proteiinien suurten aggregaattien muodostumisen pitäen siten silloijan stabiilisuutta.Optimaalisen DSS-konsentraation määrittämiseksi ja ylikuormituksen välttämiseksi altistimme solut ensin 5, 2,5 ja 1 mM DSS: iin vastaavasti 5, 10, 5 ja 30 minuuttiin ja analysoi lysaatit Coomassie-värjäyksellä SDS-PAGE: lla (tietoja ei näytetä) .Solulysaatit näyttävät olevan erittäin silloituneita alhaisimmassa pitoisuudessa ja lyhyimmässä vaiheessa.Siksi DSS titrattiin arvoon 1, 0,5 ja 0,1 mm 5 minuutin aikana (kuva 1B).Optimaalinen silloitus havaittiin 0,5 mM DSS: llä 5 minuutin ajan, ja nämä olosuhteet valittiin IFNa: lla käsiteltyihin soluihin.Lisäksi kuvio 1C näyttää Western blot -sovelluksen, joka suoritetaan käyttämällä p53 (Do-1) -vasta-ainetta proteiinien silloittamisen asteen arvioimiseksi.
Flo-1-soluja käsiteltiin 10 ng/ml IFNa:lla 24 tuntia ennen silloitusaineen lisäämistä.Silloittuneet peptidit tunnistettiin saatuista spektristä käyttämällä SIM-XL-ohjelmaa, ja yksittäiset yhdisteet yhdistettiin monimutkaiseen verkkoon käyttämällä XQuest28- ja SIM-XL29-avoimen lähdekoodin laskentaohjelmistoputkistoja (kuva 2).SIM-XL tunnistaa proteiini-proteiini-vuorovaikutukset, sisäiset ketjut ja yksittäiset ketjut yksinkertaisissa tai monimutkaisissa proteiiniseoksissa ja tarjoaa skriptejä proteiinirakenteiden vuorovaikutusten visualisointiin.Useita erittäin luotettavia proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia ja komplekseja on tunnistettu, ja uutta vuorovaikutusjoukkoa on tutkittu edelleen käyttämällä kompleksien ko-immunosaostusta ja konformaatiomuutoksia molekyylidynamiikan (MD) mallinnuksella (kuva 2) 30, 31.
Kaaviokuvaus CLMS-menetelmästä.Flo-1-soluja käsiteltiin 10 ng/ml IFNa: lla 24 tunnin ajan, mitä seurasi in situ -proteiinien silloitus DSS: llä, jota seurasi solujen hajoaminen ja trypsinisaatio.Siirrettyjä näytteitä analysoitiin käyttämällä Orbitrap-massaspektrometriä ja näytteistettiin edelleen peptidiprekursorien pirstoutumiseksi LC-MS/MS: n aikana.Kaksi kytkettyä peptidiä tunnistettiin saatuista spektristä käyttämällä silloitettujen peptidien (SIM-XL) -ohjelman spektrin tunnistuskonetta, ja kaikki yhdisteet yhdistettiin kompleksiseksi verkkoksi laskennallisilla putkistoilla.Useita uusia korkean tukemattomia proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia vahvistettiin edelleen käyttämällä samanaikaisia ​​immunosaostukseen, ja komplekseissa tutkittiin konformaatiomuutoksia käyttämällä molekyylidynamiikan (MD) mallintamista.
Yhteensä ~ 30 500 ja ~ 28 500 peptidiä havaittiin käyttämällä MaxQuantia stimuloimattomissa ja stimuloituissa IFNa -näytteissä (lisätaulukko S1, kuva 3a).Peptidin pituuden jakautuminen molemmissa tapauksissa osoitti suuremman osan suuremmista peptideistä, mikä osoittaa silloitujen peptidien läsnäolon (kuvio 3B, C).Proteiinikartoitus LOG2-intensiteettia vastaan ​​osoitti, että klassiset interferonistimuloidut proteiinit olivat runsaimmin verrattuna käsittelemättömiin näytteisiin, mukaan lukien MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 ja HLA-F (kuvio 3D).Proteiinien polkujen analyysi yli kolminkertainen rikastettu vasteena IFNa-käsittelyyn Reactom-reitin tietokantaa käyttämällä osoitti, että MHC-I-välitteinen antigeenin esitys ja prosessointi oli hallitsevin reitti (kuva 3E).Aikaisempien raporttien mukaisesti OAS: n ja ISG15: n välittämät viruksenvastaiset vasteet sekä IFNa/β- ja sytokiini -signalointi olivat aktivoituneita reittejä.Äskettäisessä tutkimuksessa ilmoitettiin 104 ISG: tä, jotka kattavat 20 virusta yhdeksästä virusluokasta yksittäisten ISG-yliekspressiotutkimusten metaanalyysillä viidessä solutyypissä9.Suurten tietojoukkojen seulonnan laskennallisten rajoitusten ratkaisemiseksi aloitimme kuitenkin pienemmällä tietojoukolla tutkiaksemme mahdollisia vuorovaikutuksia Padaria et al. Raportoima IRDS -geenien luettelo, joista suurin osa on ISG: t.

On tiedossa, että STAT1 transkriptionaalisesti säätelee näiden ISG -arvojen ilmentymistä, mutta sen vuorovaikutusta ISG: n kanssa proteiinitasolla ei ole tutkittu.STAT1: n kiderakenne osoitti, että sen kierteinen domeeni (CCD) ei ole mukana vuorovaikutuksessa DNA: n tai protomeerien kanssa dimeerien 35 muodostumisen aikana.CLMS-tietoissamme havaitsimme, että suurin osa STAT1: n vuorovaikutuksista tapahtui CCD: tä, linkkerialuetta tai C-terminaalista häntä (tähteet 700-708) (kuva 4a).Aikaisemmassa tutkimuksessa todettiin, että USP18 sitoutuu STAT2: n CCD- ja DNA: ta sitovaan domeeniin (DBD) ja rekrytoidaan tyypin I interferonireseptorin IFNAR2: n alayksikköön tyypin I interferonisignaloinnin 24 estävän välittämiseksi.Tietomme osoittivat myös, että USP18 -katalyyttinen domeeni on vuorovaikutuksessa STAT1 DBD: n kanssa (kuva 4A, D), mikä viittaa siihen, että sekä STAT1: llä että STAT2: lla voi olla merkitystä USP18: n houkuttelemisessa IFNAR2: een.
Proteiini-proteiini ISG-verkko tunnistettiin IFNa:lla käsitellyissä silloitetuissa soluissa.(A) 2D-vuorovaikutuskaavio, joka näyttää proteiini-proteiini-vuorovaikutukset (generoidaan SIM-XL-ohjelmassa), linjojen kanssa, jotka edustavat molekyylien välisiä vuorovaikutuksia (silloitusrajaksi asetettu arvoon 3.5).Eri identiteetin verkkotunnukset on merkitty värillä32: MX1-verkkotunnus, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) ja GED (569–660).OAS3-verkkotunnukset: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) ja OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) ja fn3 (777–864).STAT1-kentät: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) ja STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Silloitettujen proteiinien (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 ja STAT1) pyöreä katseluohjelma vuorovaikutuksilla ja vuorovaikutuksilla, jotka on merkitty sinisellä ja punaisella, vastaavasti.Ristisidoksen kynnysarvoksi asetettiin 3,5.Pistekaaviot osoittavat STAT1-vuorovaikutuskohtia MX1:n (C), USP18:n (D), ROBO1:n (E) ja OAS3:n (F) kanssa sekä K- tai S-vuorovaikutuskohtia näiden kahden peptidin välillä.Kuvassa ristikytkentäpisteiden kynnysarvo on 3,0.(G) Erilaiset vuorovaikutuskohdat STAT1- ja OAS3-DI-domeenien välillä päällekkäin niiden proteiinirakenteiden päällä PyMolissa (PyMOL-molekyyligrafiikkajärjestelmä, versio 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb-tunnus: 1bf533) ja OAS3 (pdb-tunnus: 4s3n34).) ohjelma.
Kaksi USP18: n isomuotoa on kuvattu ihmisillä, täysimittainen proteiini, joka sijaitsee pääosin ytimessä, ja isoformi ilman N-terminaalista domeenia, USP18-SF, joka on tasaisesti jakautunut sytoplasmassa ja ytimessä 36.Lisäksi N-pään ennustettiin olevan rakenteeton, eikä se vaadi isopeptidaasiaktiivisuutta tai ISG1537:n sitoutumista.Lisäksi tietomme osoittavat myös, että N-pää on erikoistunut proteiinien välisiin vuorovaikutuksiin.
Robo1 kuuluu transmmunoglobuliinin (IG) superperheeseen läpäisevän signalointimolekyylien ja koostuu viidestä IG -domeenista ja kolmesta fibronektiinidomeenista (FN) solunulkoisella alueella.Näitä solunulkoisia domeeneja seuraa membraani-proksimaalinen alue ja yksi kalvon läpäisy Helix 39. Strukturoimattoman solunsisäinen alue sijaitsee C-terminaalissa ja sisältää konservoituneita sekvenssimotiiveja, jotka välittävät efektoriproteiinien sitoutumista39.Aminohapoista ulottuva alue ~ 1100 - 1600 on enimmäkseen epäjärjestynyt.Havaitsimme, että MX1 on vuorovaikutuksessa Robo1: n kanssa IG: n, FN: n ja solunsisäisten domeenien kautta, kun taas suurin osa STAT1: n kanssa tapahtuvassa vuorovaikutuksessa tapahtuu sen CCD: n, linkkeridomeenin ja Robo1: n C-pään välillä (kuvio 4A, E).Toisaalta vuorovaikutukset DI-, DIII- ja OAS3 -linkkerialueiden kanssa jakautuivat koko Robo1 -proteiiniin (kuva 4A).
OAS-perhe koostuu beeta-polymeraasin (pol-β) kaltaisista nukleotiditransferaasidomeeneista.
MX proteins are part of a large family of dynein-like GTPases that contain an N-terminal GTPase domain that binds and hydrolyzes GTP, an intermediate domain that mediates self-assembly, and a C-terminal leucine zipper that acts as a GTPase (LZ ).domeenin efektoridomeeni25,43.Aikaisemmin ilmoitettu hiivan kaksihybridi-seula osoitti, että PIAS1-assosioitunut MX1 estää STAT1-välitteistä geeniaktivaatiota estämällä DNA: ta sitovaa aktiivisuutta ja sillä on myös SUMO E344,45 -ligaasiaktiivisuus.Tässä osoitamme, että MX1 sitoutuu STAT1: een (kuvio 4C, D), mutta kuinka tämä vuorovaikutus vaikuttaa STAT1-välitteiseen geenin aktivaatioon vasteena IFNa: lle tarvitsee lisätutkimusta.
Se on vuorovaikutuksessa RIG-I: n kanssa ja aktivoi sen signaloinnin ligandispesifisellä tavalla 46. DDX60 koostuu DEXD/H-laatikon helikaasidomeenista ja C-terminaalisesta helikaasidomeenista, jotka sitovat virus-RNA: ta ja DNA47: tä.Suurin osa sen vuorovaikutuksista MX1: n ja IFIT3: n kanssa tapahtuu pitkillä N- ja C-terminaalisilla alueilla, joilla ei ole kanonisia domeeneja tai motiiveja (kuva S2E, F).MX1 liittyy kuitenkin myös DEXD/H-Box-helikaasidomeeniin (kuva S2E).IFIT-perheen proteiineissa on tandem-kopiot erottuvasta helix-käännöksestä, jota kutsutaan tetrapeptiditoistoksi (TPR).IFIT3: n todettiin olevan Rig-I-signaloinnin positiivinen modulaattori ja siten MAVS-kompleksin komponentti.Yhteenvetona tietomme viittaavat siihen, että IFIT3 ja DDX60 ovat vuorovaikutuksessa pääasiassa IFIT3: n TPR 3–6: n välillä ja voi olla rooli Rig-I/MAVS-signaloinnissa (kuva S2F).
Koska koko proteomin seulonta on laskennallisesti intensiivistä, seulotimme sitten koko ihmisen uniprot-tietokannan yhden IFNa-käsitellyn toiston esiintymiseksi.Tästä kopiosta löysimme useita erittäin luotettavia vuorovaikutusverkkoja HLA-A:lle.MS/MS-spektrien tunnistamien proteiinireittien analyysi osoitti, että MHC-I-pohjainen antigeeniprosessointi ja esitys on interferonin indusoima pääreitti (kuvio 3D).Siksi keskityimme MHC-I-molekyylien proteiinivuorovaikutusten tutkimiseen suurella luotettavuudella kaikissa silloitetuissa näytteissä.HLA koostuu α1-, α2- ja α3-domeeneista ja kevyistä ketjuista, ja mikroglobuliini β2 (β2m) on vakio chaperoniproteiini49.Kun HLA on koottu endoplasmiseen retikulumiin, se on epästabiili peptidiligandien puuttuessa50.Peptidiä sitova ura muodostuu erittäin polymorfisista ja jäsentämättömistä a1- ja a2-domeeneista ei-peptidimuodossa ja suhteellisen vähemmän polymorfisen a351-domeenin.IFNa: n läsnä ollessa havaitsimme kaksi HLA-A-kompleksia: yksi on vuorovaikutuksessa HMGA1: n ja H2B: n kanssa (kuva 5, taulukko S3) ja toinen on vuorovaikutuksessa MDN1: n, LRCH4: n ja H2B: n kanssa (kuva 6).
IFNa indusoi HLA-A-vuorovaikutusverkoston H2B:n (H2BFS) ja HMGA1:n kanssa.(A) 2D-kuvaaja (generoidaan SIM-XL-ohjelmistossa), joka kuvaa erityyppisiä vuorovaikutuksia H2B-HLA-A-HMGA1-kompleksissa: interlinkki (sininen), interlinkki (punainen) ja yksi linkki (musta)..Eri identiteettien domeenit ovat värikoodeja32: H2B (histoni; 2–102) ja MHC-I (MHC_1; 25–203, ryhmä C1; 210–290 ja MHC_I_C; 337–364).Ristisidoksen kynnysarvoksi asetettiin 3,5.Pistekaaviot osoittavat HLA-A-vuorovaikutuskohtia H2B:n (B) ja HMGA1:n (C) kanssa sekä K- tai S-vuorovaikutuskohtia näiden kahden peptidin välillä.Kuvassa ristikytkentäpisteiden kynnysarvo on 3,0.(D) PyMOL-ohjelman H2B-, HLA-A- ja HMGA1-proteiinien rakenteissa esitettyjen proteiinien väliset suhteet.Nämä rakenteet mallinnettiin käyttämällä PHYRE2-palvelinta (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ja H2B: n, HLA-A- ja HMGA1-proteiinien templaattirakenteet olivat vastaavasti 1KX552, 1KJ349 ja 2EZE55.
IFNa indusoi HLA-A-vuorovaikutusverkoston H2B:n (H2BFS), MDN1:n ja LRCH4:n kanssa.(A) MDN1: llä, joka esitetään ympyräksi.Ristisidoksen kynnysarvoksi asetettiin 3,5.Eri identiteettien domeenit ovat värikoodeja32: H2B (histoni; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, ryhmä C1; 210–290 ja MHC_I_C; 337–364) ja LRCH4 (LRR_8 (68–126),, LRR_8 (137–194) ja CH (535–641)).(B) PyMOL-ohjelman H2B-, HLA-A-, LRCH4- ja MDN1-proteiinien rakenteissa esitettyjen proteiinien väliset suhteet.Nämä rakenteet mallinnettiin käyttämällä PHYRE2-palvelinta (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) mallirakenteilla 1kx552, 1KJ349, 6HLU62 ja 6I2665 H2B, HLA-A, LRCH4 ja MDN1 -proteiineille, vastaavasti.Pistekaaviot, jotka näyttävät K- tai S-vuorovaikutuskohdat HLA-A:lle H2B:n (C), LRCH4:n (D) ja MDN1:n (E) kanssa.Kaavioissa ristilinkkipisteiden kynnysarvoksi asetettiin 3,0.
Sen lisäksi, että histoni H2B ylläpitää genomin eheyttä, se osallistuu myös transkription säätelyyn.H2B-proteiini koostuu keskushistonidomeenista (HFD), joka muodostuu kolmesta silmukoilla erotetusta a-heliksestä ja C-terminaalisesta hännän 41,52.Suurin osa vuorovaikutuksesta H2B:n kanssa tapahtuu a1-kierteessä, joka saa aikaan trimerisoitumisen HFD-heterodimeerin kanssa (kuvio 5A, B).Vaikka lysiinit osallistuvat DNA:n sitomiseen, jotkut lysiinit ovat myös vaihtoehtoisia asetylaatio- tai metylaatiokohtia.Esimerkiksi H2B: n tähteet K43, K46 ja K57 eivät ole mukana suorassa DNA: n sitoutumisessa, vaan ovat erilaisten transkription jälkeisten modifikaatioiden kohteita53.Samoin tähteillä K44, K47 ja K57 H2B: ssä voivat olla vaihtoehtoinen rooli IFNa: n läsnä ollessa, mukaan lukien vuorovaikutukset muiden proteiinien kanssa (kuvio 5A, B).Lisäksi ekstrakromosomaalinen histoni H2B aktivoi immuunivasteen erilaisissa solutyypeissä, jotka toimivat sytosolisen anturina tartunta-aineista tai vaurioituneista soluista johdettujen kaksijuosteisten DNA (DSDNA) -fragmenttien havaitsemiseksi.DNA-virusten läsnä ollessa H2B-depletio esti IFN-β:n tuotantoa ja STAT154:n fosforylaatiota.H2B:n tiedetään myös liikkuvan ytimeen ja sieltä ulos nopeammin kuin muiden ydinhistonien54.H2B-vuorovaikutuksia MDN1:n ja LRCH4:n kanssa havaittiin myös valituissa käsittelemättömissä näytteissä.Havaitsimme, että HLA-A oli vuorovaikutuksessa H2B:n kanssa kaikissa kolmessa IFNa-käsitellyssä näytteessä ja yhdessä käsittelemättömässä toistuvassa näytteessä.Nämä tiedot heijastavat H2B:n roolia vaihtoehtoisessa fysiologisessa toiminnassa, joka on riippumaton transkription säätelystä.
HMGA1 (high Mobility Group AT-Hook 1), pieni nukleoproteiini, joka sisältää runsaasti sairautta edistäviä aminohappoja, on tunnistettu yhdessä HLA-A:n kanssa.Siinä on hapan C-terminaalinen häntä ja kolme erillistä DBD:tä, joita kutsutaan AT-koukkuiksi, koska ne sitoutuvat dsDNA55,56:n AT-rikkaan alueen pienempään uraan.Tämä sitoutuminen saa DNA:n taipumaan tai suoriutumaan, jolloin kanoniset transkriptiotekijät pääsevät käsiksi sen konsensussekvenssiin.C-terminaalisen hännän uskotaan osallistuvan proteiini-proteiini-vuorovaikutuksiin ja transkriptiotekijöiden keräämiseen, koska C-terminaaliset deleetiomutantit eivät pysty aloittamaan transkriptiota57.Lisäksi tämä domeeni sisältää useita konservoituneita fosforylaatiokohtia, jotka ovat tunnettuja kinaasien substraatteja58.Havaitsimme HLA-A- ja H2B-vuorovaikutuksia HMGA1:n kanssa C-terminaalisen domeenin ulkopuolella, mikä viittaa siihen, että C-terminaalista domeenia käytetään pääasiassa transkriptiotekijän sitoutumiseen (kuvio 5A, C).HMGA-proteiinit kilpailevat histoni H1:n kanssa sitoutumisesta sovittimen DNA:han, mikä lisää saavutettavuutta57.Samoin näyttää todennäköiseltä, että HMGA on vuorovaikutuksessa histoni H2B:n kanssa linkkeri-DNA:ta pitkin ja kilpailee histoni H1:n kanssa.HMGB1 indusoi HLA-A:n, -B:n ja -C:n ilmentymistä dendriittisoluissa, mikä johtaa niiden aktivaatioon59, mutta vuorovaikutusta HMG:n ja HLA:n välillä ei ole aiemmin raportoitu.Havaitsimme, että HMGA1 on vuorovaikutuksessa HLA-A:n α1- ja α3-domeenien kanssa, ja suurin osa vuorovaikutuksista on sen 3 DBD:n ulkopuolella (kuvio 5A, C).Käsissämme HLA-A:n havaittiin lokalisoituneen tumaan (tietoja ei esitetty), ja koska H2B ja HMGA1 ovat myös läsnä ytimessä, tämä vuorovaikutus tapahtuu todennäköisesti ytimessä.Spesifiset adduktiot mitattuna H2B:n, HLA-A:n ja HMGA1:n välillä on esitetty kuviossa 5D.
Se on kalvoproteiini, jossa on yhdeksän leusiinirikasta toistoa (LRR) ja kalmoduliini (CH) homologia-motiivi sen ektodomeenissa, jota seuraa transmembraanidomeeni (TMD)60,62.CH-domeenien on raportoitu välittävän proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia 60 .Noin 300 aminohapon jakso LRR- ja CH-domeenien välillä on suhteellisen helposti saavutettavissa, mutta epäjärjestynyt.Perustuen häiriintyneiden alueiden toimintoon proteiini-proteiiniverkostojen ja vesikulaarikuljetuksen välittäjinä 63, havaitsimme, että useimmat proteiinivuorovaikutukset tapahtuvat epäjärjestyneillä alueilla.Vuorovaikutukset MDN1:n kanssa jakautuivat koko proteiinin pituudelle, mukaan lukien LRR1-, LRR6-, CH-domeenit ja satunnaiset alueet, kun taas H2B sitoutui pääasiassa CH-domeeniin (kuvio 6A, B).Erityisesti mikään vuorovaikutuksista ei sisältänyt TMJ:tä, mikä viittaa CLMS-lähestymistavan spesifisyyteen (kuvio 6A, B).
MDN1 on myös tunnistettu osaksi HLA-A-proteiiniverkostoa (kuvio 6A).Se kuuluu AAA-proteiinien perheeseen (eri toimintaan liittyvät ATPaasit).Tämä on sama N-terminaalinen AAA-domeeni, joka organisoituu heksameerirenkaaksi ja poistaa kokoamistekijän 60S 64 ribosomaalisesta alayksiköstä.näyttää olevan samanlainen kuin dynein64, 65, 66.MDN1:n suuren koon (noin 5600 aminohappoa) ja sen rajoitetun homologian vuoksi hyvin tutkittujen proteiinien kanssa sen rakenteesta ja toiminnasta ihmisillä tiedetään vain vähän.Lisäksi äskettäinen tutkimus raportoi myös MDN:n ja HLA-B:n välisestä vuorovaikutuksesta HCT116-soluissa käyttämällä affiniteettipuhdistettua massaspektrometriaa, mikä tukee havaintojamme68.Tämän kompleksin tunnistaminen IFNa-käsitellyistä näytteistä viittaa MDN1:n rooliin interferonisignalointissa.
Koska HLA -geenit ovat erittäin polymorfisia, uutetimme sekvensointi lukee HLA -A: n, -b: n ja -C: n kartoittamista Flo -1 -solujen RNA -sekvensointitiedoista (tietoja ei esitetty).Peptidisekvenssit, jotka ovat yhdenmukaisia ​​sekvensointilukemisen kanssa, paljastivat merkittäviä eroja HLA-A: n, -b: n ja -C: n välillä alueilla, joilla silloitetut peptidit sijaitsivat HLA-A: ssa (kuva S3).Lisäksi emme havainneet HLA-B/C-molekyylien proteiineja-proteiinien silloitusta H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4-proteiineilla.Tämä viittaa siihen, että HLA-A: n, MDN1: n, LRCH1: n ja HMGA1: n välillä löydetty proteiinien vuorovaikutus on HLA-A-spesifinen.Lisäksi silloittamattomien näytteiden proteominen analyysi (taulukko S4) osoitti, että HLA-A:lla on suurempi sekvenssipeitto verrattuna HLA-B:hen tai HLA-C:hen.HLA-A:lle tunnistetut peptidit olivat voimakkaita sekä IFNa-käsitellyissä että käsittelemättömissä näytteissä.
Jotta varmistetaan, että tässä havaitut vuorovaikutukset eivät johdu kahden proteiinin epäspesifisestä silloituksesta läheisessä alueellisessa läheisyydessä, vahvistimme edelleen kaksi uutta HLA-A-vuorovaikutusta tekijää suorittamalla samanaikaisesti immunosaostomääritystä.Vahvistimme, että HLA-A: n H2B vangitsi immunosaostuksissa ja että tämä assosiaatio johtui IFNa-hoidosta, koska HLA-A: ta ei ollut käsiteltämättömien solujen immunosaostusnäytteissä (kuva 7A).Havaitsimme, että MDN1 liittyi HLA-A: iin kontrolleissa ja IFNa: n lisääminen vähensi tätä vuorovaikutusta riippumatta MDN1-induktiosta IFNa: lla (kuvio 7B, C).Yhdessä nämä tulokset tukevat HLA-A: n interferonivälitteisiä vuorovaikutuksia H2B: n ja MDN1: n kanssa.
HLA-A puhdistaa yhdessä H2B:n ja MDN1:n.Edustavat endogeeniset H2B (A )- ja MDN1 (B) -immunoblotit immunosaostettiin IFNa-käsitellyistä Flo-1-soluista ja tutkittiin ilmoitettuihin vasta-aineisiin.Hiiren ja kanin IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina.(C) Eri antigeenien suhteelliset määrät (syöttö) on kuvattu osoitettujen vasta-aineita vastaan ​​koettujen immunobloteilla, P-aktiinina käytettiin kuormituskontrollina.
Yhden interferonin aiheuttaman erittäin luotettavan silloitetun verkon, H2B-HLA-A-HMGA1:n, rakenteellisia ominaisuuksia tutkittiin.Käytimme molekyylidynamiikan mallintamista vaihtoehtoisena lähestymistapana ymmärtääksesi tässä kompleksissa mukana olevien proteiinien konformaatiodynamiikkaa (kuva 8).CLMS-tiedoista tehdyt päätelmät viittaavat H2B-, HLA-A- ja HMGA1-proteiinien erilaisten konformaatioiden mahdollisuuteen.Siksi seuraavat mahdolliset kompleksit mallinnettiin liuotinväliaineessa: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A ja H2B-HLA-A-HMGA1.Alkuperäinen proteiini-proteiini-telakointinäyttö käyttämällä MOE: tä (molekyylitoimintaympäristö; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) -paketti ehdotti mahdollisia konformaatioita, jotka eroavat näiden proteiinien välillä (kuva 8A).Telakointiproteiinikompleksin visualisointi paljasti useita vuorovaikutuksia ja mahdollisia konformaatioita (kuvio 5A, 8).Siten yksi mahdollinen konformaatio on esitetty kuvassa 8A (merkityillä ristisidoksilla) ja sitä arvioitiin edelleen käyttämällä MD-mallinnusliukuhihnaa.Lisäksi H2B:n tai HMGA1:n sitoutuminen HLA-A:han korostaa H2B:n korkeampaa affiniteettia HLA-A:han (kuvio 8A).
H2B (H2BFS)-HLA-A-, HMGA1-HLA-A- ja H2B-HLA-A-HMGA1-kompleksien välisten mahdollisten verkkojen konformaatiodynamiikka.(A) Vasen paneeli on 2D-kartta (generoitu SIM-XL-ohjelmistossa) molekyylinsisäisistä (punainen) ja molekyylien välisistä (sininen) silloksista (ristilinkin raja-arvoksi asetettu 3,5).Vasemmanpuoleinen alapaneeli näyttää H2B-HLA-A- ja HMGA1-HLA-A-kompleksien erilaiset mahdolliset konformaatiot, joilla on erilaiset proteiini-proteiinisitoutumisaffiniteetit (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(C) molekyylien väliset proteiini-proteiini vetysidosvuorovaikutukset erilaisista simuloiduista komplekseista ottaen huomioon spesifiset vuorovaikutukset, joiden kesto on ≥ 10 ns.H-sidoksen luovuttaja-akseptorin katkaisuetäisyys asetettiin arvoon 3,5 Å, ja luovuttaja-H-akseptorin rajakulmaksi asetettiin ≥ 160°–180°.(D) Leimatut tähteet, jotka muodostavat HLA-A-proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia vastaavien kumppaneidensa kanssa, jotka kattavat ≥ 20 ns, uutettu vale-HLA-A-H2B- ja HLA-A-HMGA1-komplekseista.Proteiinirakenteet edustavat 100 ns MDS:n keskimääräistä rakennetta.(E) Vuorovaikutukset HLA-A-H2B- ja HLA-A-HMGA1-kompleksien välillä verrattuna vuorovaikutuksiin, jotka on seurattu H2B-HLA-simulaatiolla yli 100 ns:n aikana perustuen K- tai S-vuorovaikutuskohtaan kahden peptidin välillä.Kompleksit /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Ristisidosten arvioinnin kynnysarvoksi asetettiin 3,0, ja MDS:n spesifiset vuorovaikutukset, jotka kestivät ≥ 10 ns, otettiin huomioon.Proteiinirakenteet visualisoitiin käyttämällä BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) ja Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) paketteja.
HLA-A-molekyylien stabiilius ajan kuluessa (keskihajonta; RMSD tai standardipoikkeama; RMSF) osoitti, että H2B- tai HMGA1-proteiinien läsnäolo komplekseissa stabiloi HLA-A:ta (kuvio 8B, kuva S5).HMGA1-proteiini sitoutuu tiukasti HLA-A:n B2M-kohtaan indusoiden HLA-A-aminohappojen stabiiliutta HLA-A-HMGA1- tai H2B-HLA-A-HMGA1-kompleksissa (kuvio 8B, kuva S5).erityisesti HLA-tähteiden ~60-90 ja ~180-210 havaittiin olevan vähemmän joustavia H2B:n läsnä ollessa (kuvio 8B).H2B ja HMGA1 osoittivat parempaa sitoutumista HLA-A:han H2B-HLA-A-HMGA1-kompleksissa verrattuna HLA-A:n sitoutumiseen H2B:hen tai HMGA1:een yksin (kuvio 8C, D; taulukko S5).Vetysidokseen osallistuvat jäännökset (MD-mallinnettu korkea käyttöaste ≥ 10 ns) osuvat yhteen kompleksin CLMS-vuorovaikutuskohtien (K- tai S-tähteet) kanssa, mikä viittaa siihen, että CLMS:n tunnistamat vuorovaikutukset ovat erittäin luotettavia.Luotettavuus (kuva 8E ).CLMS- ja MD-mallinnuksessa HLA-A-tähteiden välillä noin 190-210 ja noin 200-220 aminohappoa havaittiin sitovan H2B:tä ja vastaavasti HMGA1:tä (kuvio 8E).
Proteiini-proteiini-vuorovaikutukset muodostavat dynaamisia rakenteellisia verkostoja, jotka välittävät solunsisäistä viestintää vasteena tiettyihin ärsykkeisiin.Koska monet proteomiikkalähestymistavat havaitsevat muutokset proteiinin yleisen tasaisen tilan tasolla, proteiini-proteiini-vuorovaikutusdynamiikka vaatii lisätyökaluja sitoutumisrajapintojen sieppaamiseksi ja CLMS on yksi tällainen työkalu.Interferonin signalointijärjestelmä on sytokiiniverkko, jonka avulla solut voivat reagoida moniin ympäristöön patogeenisiin ja luontaisiin patologisiin signaaleihin, jotka huipentuvat interferonin indusoitavien proteiinien alajoukkojen induktioon.Käytimme CLMS:ää määrittääksemme, voidaanko uusia proteiini-proteiinivuorovaikutuksia tunnistaa interferonin indusoimien proteiinien joukosta.Proteiinikompleksien sieppaamiseen käytettiin globaalia proteiinien ristisilloitusanalyysiä interferonille reagoivassa Flo-1-solumallissa.Tryptisten peptidien uutto ei-ristikkäisistä ja silloittuneista soluista mahdollistaa peptidien laskennan, reitin rikastumisen ja peptidin pituuden jakautumisen määritellyn LFQ-intensiteetin kanssa.Kanoninen interferonin indusoitavat proteiinit tunnistettiin positiiviseksi sisäiseksi kontrolliksi, kun taas uudet molekyylienväliset ja molekyylien sisäiset silloitetut adduktit kanonisista interferonin indusoitavista proteiineista, kuten MX1, UP18, OAS3 ja STAT1, havaittiin.Erilaisia ​​rakenteellisia piirteitä ja vuorovaikutuksia toiminnallisilla alueilla on tutkittu.
Vuorovaikutus HLA-A:n, MDN1:n ja H2B:n välillä havaittiin immunoblottauksella IFNa:lla käsitellyissä ja käsittelemättömissä Flo-1- ja A549-soluissa.Tuloksemme korostavat, että HLA-A kompleksoituu H2B:n kanssa IFNa-riippuvaisella tavalla.Työmme edustaa mielenkiintoista väylää näiden kahden kompleksin rinnakkaispaikannukseen.Olisi myös mielenkiintoista laajentaa CLMS-lähestymistapaa solulinjojen paneeliin solutyypistä riippumattomien interferonivälitteisten proteiinivuorovaikutusten tunnistamiseksi.Lopuksi käytimme MD-mallinnusta vaihtoehtoisena lähestymistapana ymmärtääksemme H2BFS-HLA-A-HMGA1-kompleksiin osallistuvien proteiinien konformaatiodynamiikkaa, joka seurasi molekyylinsisäisiä ja molekyylien välisiä ristipuheluita.Mahdolliset erilaiset konformaatiot näiden telakointiproteiinikompleksien välillä paljastivat useita vuorovaikutuksia, jotka ovat samanlaisia ​​kuin CLMS-tietojoukossa havaitut.Yksi menetelmämme tärkeimmistä vahvuuksista on, että se mahdollistaa vuorovaikutuksessa olevien erittäin polymorfisten geenien, kuten HLA:n, helpon tunnistamisen, joten on mielenkiintoista tutkia HLA-haplotyyppispesifisten proteiinien vuorovaikutuksia, joita muutoin on vaikea tutkia.Yhteenvetona tietomme osoittavat, että CLMS:ää voidaan käyttää laajentamaan ymmärrystämme interferonin indusoimista signalointiverkostoista ja tarjota perusta monimutkaisempien solujen välisten järjestelmien tutkimiseen kasvaimen mikroympäristössä.
Flo-1-solut saatiin ATCC: ltä ja pidettiin DMEM: ssä (GIBCO), jota oli täydennetty 1% penisilliinillä/streptomysiinillä (Invitrogen), 10% naudan sikiön seerumilla (GIBCO) ja varastoitiin 37 ° C: ssa ja 5% CO2: ssa.Inkubointi.Soluja kasvatettiin 70-80%: n konfluenssiin ennen kuin niitä käsiteltiin IFNa14: llä (valmistettu Edinburghin proteiinin tuotantolaitoksella).Kaikki muut kemikaalit ja reagenssit ostettiin Sigma Aldrichilta, ellei toisin mainita.
Flo-1-soluja viljeltiin 6-kuoppalevyillä ja seuraavana päivänä soluja käsiteltiin 10 ng/ml IFNa14: llä 24 tunnin ajan noin 80%: n konfluenssiin.Solut pestiin kolme kertaa PBS: llä ja ligoitiin vasta valmistetuilla DS: llä (Thermo Fisher Scientific) (liuennettu DMSO: hon) PBS: ään 5 minuutin ajan 37 ° C: ssa lopulliseen pitoisuuteen 0,5 mM.DSS:n silloitusreaktio korvattiin PBS:llä ja jäännös-DSS sammutettiin lisäämällä 20 mM Tris (pH 8,0) PBS:ssä 15 minuutin ajan 37 °C:ssa.Solut kerättiin kaapimalla ja kerättiin vähän sitoutuviin putkiin (Axygen).
Solupelletti hajotettiin 300 ui: lla urean hajotuspuskuria (8 M urea, 0,1 M Tris, pH 8,5) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa satunnaisesti ravistamalla.Kaikki sentrifugointivaiheet suoritettiin 14 000 xg:ssä 8 °C:ssa.Sentrifugoi lysaattia 10 minuuttia ja siirrä supernatantti uuteen putkeen.Jäljellä olevat kirkkaat hiukkaset liuotettiin 150 μl: aan toista hajotuspuskuria (2 M urea, 2% (paino/tilavuus) SDS (natriumdekyylisulfaatti)) vähintään 30 minuuttia, kunnes saatiin homogeeninen vesiliuos.Lysaattia sentrifugoitiin 20 minuuttia ja supernatantti sekoitettiin edellisessä vaiheessa saadun lysaatin kanssa.Proteiinipitoisuudet arvioitiin käyttämällä MICRO BCA -määritystä (Thermo Fisher Scientific) valmistajan mikrolevymenetelmien ohjeiden mukaisesti.Näytteet jäädytettiin nopeasti nestetypessä ja säilytettiin -80 °C:ssa.
Noin 100 μg liukoista silloitettua proteiinia prosessoitiin käyttämällä modifioitua suodatusnäytteen valmistusprotokollaa (FASP), kuten Wisniewski et ai.Kaikki sentrifugointivaiheet suoritettiin 14 000 xg:ssä 25 °C:ssa.Ensimmäinen puolisko silloitetusta proteiinilysaatista siirrettiin 10 kDa:n Microcon-sentrifugisuodatinlaitteeseen, joka oli varustettu Ultracel-10-kalvolla (Merck), minkä jälkeen sentrifugoitiin suodattimella 25 minuuttia.Lisää sitten proteiinin toinen puolikas suodattimeen ja toista samat vaiheet.Proteiinin talteenotto suoritettiin lisäämällä 100 μl 17 mM tris(2-karboksietyyli)fosfiinihydrokloridia (TCEP) ureapuskurissa.Talteenottoa sekoitettiin lämpösekoittimessa nopeudella 600 rpm 30 minuuttia 37 °C:ssa.Lisäksi kolonni sentrifugoitiin ja pelkistetty silloitettu proteiini alkyloitiin käyttämällä 100 µl 50 mM jodiasetamidia ureapuskurissa.Alkylointireaktio suoritettiin huoneenlämpötilassa 20 minuuttia pimeässä.Pyöritä kolonnia, pese kolonnin seinämät 3 kertaa 100 µl:lla ureapuskuria ja sentrifugoi sitten.Sama toimenpide suoritettiin 3 kertaa käyttämällä 100 µl 100 mM ammoniumbikarbonaattia.
C18 Micro Spin -pylväitä (Harvard Apparatus) käytettiin suolan poistamiseen silloittuneista tryptisteistä peptidien Bouchal et ai.70 kuvaaman protokollan mukaisesti pienin muutoksin.Lyhyesti sanottuna C18-spinkolonnit aktivoitiin kolmella pesulla 0,1 % muurahaishapolla (FA) asetonitriilissä (AcN) (Merck) ja kahdella pesulla 0,1 % FA:lla.Kolonnia hydratoitiin 0,1 % FA:lla 15 minuuttia.Eluoidut peptidit liuotettiin 100 µl:aan 0,08 % trifluorietikkahappoa 2,5 % AcN:ssä ja pitoisuudet mitattiin NanoDrop 2000:lla (Thermo Scientific).
Silloitetut peptidit erotettiin UltiMate 3000 RSLCnano LC -järjestelmällä (Thermo Scientific), joka oli yhdistetty Orbitrap Exploris 480 -massaspektrometriin (Thermo Scientific).Silloitetut peptidit kerättiin 300 um ID:n, 5 mm pitkälle u-esikolonni C18 sieppauspylvääseen, joka oli pakattu C18 PepMap100 sorbentilla ja 5 um PepMap sorbentilla (Thermo Scientific).Lataa pumpun virtaussarja 5 µl/min 0,08 % trifluorietikkahappoa liuotettuna 2,5 % AcN:ään.Silloitetut peptidit erotettiin analyyttisellä fuusioidulla piidioksidikolonnilla, jonka sisähalkaisija oli 75 µm ja pituus 150 mm ja joka oli täytetty 2 µm:n PepMap-sorbentilla (Thermo Scientific).Liikkuvat faasit A ​​ja B koostuivat 0,1 % FA:sta vedessä ja 0,1 % FA:sta asetonitriilissä, vastaavasti.Gradientti alkaa 2,5 %:sta B ja kasvaa lineaarisesti 40 %:iin B:tä 90 minuutin aikana, sitten 90 %:iin B:tä seuraavien 2 minuutin aikana.Liikkuvan faasin koostumus pidettiin 90 %:ssa B:tä 10 minuuttia ja sitten se pieneni lineaarisesti 2,5 %:iin B:tä 2 minuutin aikana.Kolonni tasapainotettiin 2,5 % B:llä 8 minuuttia ennen seuraavaa sykliä.Analyyttisesta kolonnista eluoidut ristisilloitetut peptidit ionisoitiin nanoelektrosumutusionisaatiolähteessä (NSI) ja injektoitiin Exploris 480 -massaspektrometriin (Thermo Scientific).
Orbitrap Exploris 480 -massaspektrometri toimi positiivisessa datakorrelaatiotilassa.Täysi skannaus suoritettiin leikkaustilassa 120 000 resoluutiolla alueen asetuksilla m/z 350 Th - m/z 2000 Th.Normalisoitu AGC-tavoite asetettiin 300 %:iin maksimituloajalla 50 ms.Peptideille on vahvistettu monoisotooppisten huippujen havaitseminen.Rajoituksen relaksaatioparametri asetetaan arvoon tosi, jos esiasteita löytyy liian vähän.Esiasteen vähimmäisionivahvuus asetettiin arvoon 5,0e3 ja kokeisiin sisällytettiin esiastevaraustilat +8 asti.
Suurten skannausten välinen sykliaika datakorrelaatiotilassa asetettiin 2,5 sekuntiin.Dynaaminen massan poissulkeminen asetettiin 20 sekuntiin prekursori-ionin ensimmäisen fragmentoinnin jälkeen.Esiasteen eristysikkunaksi asetettiin 2 Th.Normalisoidun törmäysenergian tyyppi kiinteällä törmäysenergiamoodilla valittiin tiedoista riippuvaisessa MS/MS-skannauksessa.Törmäysenergiaksi asetettu 30 %.Orbitrap-resoluutioksi asetettiin 15 000 ja AGC-tavoitteeksi 100 %.Mukautettu enimmäisinjektioaika on 60 millisekuntia.
Ennen proteiini-proteiiniverkon seurantaa silloittuneissa näytteissä prosessoimme RAW-tiedostot MaxQuant-paketin (versio 1.6.12.0) 26,27 käyttämällä näytteiden jäljitettäviä peptidejä/proteiineja.Lisäksi samanlaiset proteomianalyysit suoritettiin silloittamattomille Flo-1-näytteille, jotka oli käsitelty ja käsittelemättöminä IFNa:lla.MS/MS-tietoja haettiin UniProt-ihmistietokannasta (www.uniprot.org) (ladattu 12. elokuuta 2020, sisältää 75 093 merkintää) sisäänrakennetulla hakukoneella Andromeda27.Esiastemassatoleranssit asetettiin arvoon 20 ppm ja tuoteionien arvoon 0,02 Da.Alku- ja maksimimassapoikkeama asetettiin arvoon 10 ppm.Proteiinipitoisuus laskettiin normalisoimalla proteiinin spektrin intensiteetti (LFQ-intensiteetti; leimaamaton kvantifiointi)27 ja intensiteettiarvot muutettiin Log2:ksi.Reitin rikastusanalyysi suoritettiin käyttämällä Reactome-polkutietokantaa IFNa-käsitellyille proteiineille, jotka olivat yli neljä kertaa aktivoituneita käsittelemättömiin näytteisiin verrattuna.
Proteiinikompleksien lysiinille (K) tai seriinille (S) spesifisten kemiallisten ristisidosten tunnistus, jota seurattiin LC-MS/MS:llä, suoritettiin käyttämällä spektroskooppista tunnistuskonetta (SIM-XL) silloitettujen peptidien (SIM-XL)29 suhteen.Ensinnäkin mahdollisia vuorovaikutuksia interferoniin liittyvien (IFN) DNA-vaurioresistenssisignatuuri (IRDS) -geenien välillä tutkittiin käyttämällä IRDS-proteiinitietoaineistoa, joka on kuvattu julkaisussa Padariya et al.28.Kaikkien olosuhteiden ja koko ihmisen UniProtin toistojen seulonta on laskennallisesti intensiivistä, joten koko ihmisen UniProt-tietokanta (www.uniprot.org) (ladattu 12. elokuuta 2020, sisältää 75 093 merkintää) IFNα-käsiteltyjä toistoja vastaan.Yksi korkean luotettavuuden vuorovaikutusten suodattimista.
SIM-XL:ssä DSS:ää käytettiin silloittajalle (XL) ja XL-painonsiirto ja modifikaatiopainon muutos asetettiin arvoon 138,06 ja 156,07.XCorr-dynaamisen DB-vähennyskynnys ja dynaamisen DB-vähennyksen peptidien vähimmäismäärä asetettiin arvoon 2,5 ja 2, vastaavasti.Muut parametrit ovat: monoisotoopin todennäköisyys ja huipun yhteensattumaraja, vähintään 4 AA-tähdettä säiettä kohden ja maksimi säikeen varaus ja 3 maksimimäärää puuttuvia jakoja.Tuloksena saadut ommeltu 2D-kartat analysoitiin (SIM-XL) ja xQuest28-graafista esitystä käytettiin 2D-karttojen rakentamiseen.Proteiinin ristisidokset proteiinirakenteissa tarjotaan PyMolissa (PyMOL Molecular Graphics System, versio 2.0 Schrödinger, LLC).
Proteiinimallirakenteet luotiin Phyre2-palvelimella (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 käyttäen homologiamallinnuksen periaatteita ja "Hidden Markov -menetelmän" toteutusta.Proteiinirakenne visualisoitiin käyttämällä BIOVIA Discovery Studio Visualizer -pakettia (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) ja Molecular Operating Environment -pakettia (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).