347 12.7*1.24mm Ruostumattomasta teräksestä valmistettu kierreputki

Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käytät selainversiota, jossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Liukusäätimet, joissa näkyy kolme artikkelia per dia.Käytä Takaisin- ja Seuraava-painikkeita liikkuaksesi diojen välillä tai diaohjaimen painikkeita lopussa.

347 ruostumattomasta teräksestä valmistettujen putkien tekniset tiedot

347 12,7*1,24mm Ruostumattomasta teräksestä valmistettu kierreputki

Ulkohalkaisija: 6,00 mm OD - 914,4 mm OD, koot jopa 24" NB saatavana Varastossa, ulkohalkaisijan koko Teräsputket saatavana Varastossa

SS 347 putken paksuusalue: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S jne. (0,5-12 mm) Tai epätavallinen koko, joka räätälöidään tarpeen mukaan

Tyyppi: SS 347 saumattomat putket |SS 347 ERW -putket |SS 347 hitsatut putket |SS 347 valmistetut putket |SS 347 CDW-putket, LSAW-putket / saumahitsattu / uudelleen piirretty

Muoto: SS 347 pyöreät putket/ putket, SS 347 neliöputket/ putket, SS 347 suorakulmaiset putket/ putket, SS 347 kierreputket, SS 347 "U" muoto, SS 347 pannukakkukelat, SS 347 hydrauliputket

Pituus: yksittäinen satunnainen, kaksinkertainen satunnainen ja vaadittu pituuspää: tasainen pää, viisto pää, päällystetty

Päädyn suojaus: Muovikorkit |Ulkopinta: 2B, nro 4, nro 1, nro 8 peilipinta ruostumattomille teräsputkille, viimeistely asiakkaan vaatimusten mukaan

Toimitustila: hehkutettu ja peittattu, kiillotettu, kirkashehkutettu, kylmävedetty

Tarkastus, testiraportit: tehtaan testaustodistukset, EN 10204 3.1, kemialliset raportit, mekaaniset raportit, PMI-testiraportit, visuaaliset tarkastusraportit, kolmannen osapuolen tarkastusraportit, NABL:n hyväksymät laboratorioraportit, tuhoavien testien raportti, ainetta rikkomattomat testiraportit

Pakkaus: Pakattu puulaatikoihin, muovipusseihin, teräsnauhoihin niputettuna tai asiakkaan pyynnöstä

Erikoistarjoukset: Muut kuin yllä olevat koot ja tekniset tiedot voidaan valmistaa pyynnöstä

SS 347 -putkikokoalue: 1/2 tuumaa NB, ulkohalkaisija - 24 tuumaa

ASTM A312 347: Saumaton ja suorasaumahitsattu austeniittiputki, joka on tarkoitettu korkeaan lämpötilaan ja yleiseen syövyttävään käyttöön.Täytemetallia ei sallita hitsauksen aikana.

ASTM A358 347: Sähköhitsattu austeniittiputki syövyttävään ja/tai korkean lämpötilan käyttöön.Tyypillisesti vain 8 tuuman putkia valmistetaan tämän spesifikaation mukaisesti.Täytemetallin lisääminen on sallittu hitsauksen aikana.

ASTM A790 347: Saumaton ja suorasaumahitsattu ferriitti/austeniitti (dupleksi) putki, joka on tarkoitettu yleiseen syövyttävään käyttöön, painottaen erityisesti jännityskorroosiohalkeilun kestävyyttä.

ASTM A409 347: Suorasauma tai spiraalisauma sähköhitsattu suurihalkaisijainen austeniittiset valoseinäputket koot 14" - 30" seinämillä Sch5S ja Sch 10S syövyttävälle ja/tai korkealle

ASTM A376 347: Saumaton austeniittinen putki korkean lämpötilan sovelluksiin.

ASTM A813 347: Yksisaumainen, yksi- tai kaksoishitsattu austeniittiputki korkeissa lämpötiloissa ja yleisissä syövyttävissä sovelluksissa.

ASTM A814 347: Kylmätyöstetty hitsattu austeniittinen putki korkean lämpötilan ja yleiseen syövyttävään käyttöön.

347H ruostumattomasta teräksestä valmistettujen putkien kemiallinen koostumus

Ruostumattoman teräksen 347H putken mekaaniset ominaisuudet

Ruostumattomasta teräksestä valmistettujen 347H putkien fyysiset ominaisuudet

Vastaavat laadut 347H ruostumattomalle teräsputkelle

Amyloidialfa-synukleiinin (αS) aggregaatio on Parkinsonin taudin ja muiden synukleinopatioiden tunnusmerkki.Äskettäin Alzheimerin tautiin yleisesti liittyvä tau-proteiini on liitetty aS-patologiaan, ja sen on havaittu lokalisoituvan yhdessä runsaasti aS-proteiinia sisältäviin inkluusioihin, vaikka näiden kahden proteiinin koaggregaation molekyylimekanismi on edelleen epäselvä.Raportoimme tässä, että αS-faasi erottuu nestemäisiksi kondensaatteiksi sähköstaattisen kompleksisen kondensaation kautta positiivisesti varautuneiden polypeptidien, kuten taun, kanssa.Riippuen αS:n affiniteetista polykationeja kohtaan ja hyytymisverkoston valenssivajeen nopeudesta, hyytymät käyvät läpi nopean geeliytymisen tai yhteensulautumisen, jota seuraa hidas amyloidiaggregaatio.Yhdistämällä joukon kehittyneitä biofysikaalisia tekniikoita pystyimme karakterisoimaan neste-neste αS/Tau-faasierotuksen ja tunnistamaan avaintekijät, jotka johtavat heterogeenisten aggregaattien muodostumiseen, jotka sisältävät molempia proteiineja nestemäisessä proteiinikondensaatissa.
Membraaniosastojen lisäksi tilaerottelu soluissa voidaan saavuttaa myös muodostamalla proteiinipitoisia, nestemäisiä tiiviitä kappaleita, joita kutsutaan biomolekyylikondensaateiksi tai pisaroiksi neste-nestefaasierotuksena (LLPS) tunnetun prosessin kautta.Nämä pisarat muodostuvat moniarvoisista ajallisista vuorovaikutuksista, yleensä proteiinien tai proteiinien ja RNA:n välillä, ja ne palvelevat erilaisia ​​​​toimintoja melkein kaikissa elävissä järjestelmissä.Suuri määrä LLP-kykyisiä proteiineja esittelee sekvenssejä, joiden monimutkaisuus on alhainen ja jotka ovat luonteeltaan ja biomolekyylikondensaattien muodostuksessa erittäin epävakaita3,4,5.Lukuisat kokeelliset tutkimukset ovat paljastaneet näiden nestemäisten kondensaattien muodostavien proteiinien joustavan, usein epäjärjestyneen ja moniarvoisen luonteen, vaikkakin vain vähän tiedetään spesifisistä molekyylideterminanteista, jotka säätelevät näiden kondensaattien kasvua ja kypsymistä kiinteämmäksi. osavaltio..
Uudet tiedot tukevat hypoteesia, että poikkeava proteiinivetoinen LLPS ja pisaroiden muuttuminen kiinteiksi rakenteiksi voivat olla tärkeitä solureittejä, jotka johtavat liukenemattomien myrkyllisten aggregaattien muodostumiseen, jotka ovat usein degeneratiivisten sairauksien tunnusmerkkejä.Monet LLPS:ään liittyvät luontaisesti häiriintyneet proteiinit (IDP:t), jotka ovat usein erittäin varautuneita ja joustavia, on pitkään yhdistetty hermosolujen rappeutumiseen amyloidiaggregaatioprosessin kautta.Erityisesti biomolekulaaristen IDP-kondensaattien, kuten FUS7 tai TDP-438, tai proteiinien, joissa on suuria matalan kompleksisuuden domeeneja, kuten hnRNPA19, on osoitettu vanhenevan geelimäisiksi tai jopa kiinteisiin muotoihin fluidisaatioksi kutsutun prosessin kautta.yhdiste.kiintofaasisiirtymään (LSPT) ajan funktiona tai vasteena tietyille translaation jälkeisille modifikaatioille tai patologisesti merkittäville mutaatioille1,7.
Toinen LLPS:ään in vivo liittyvä IDP on Tau, mikrotubuluksiin liittyvä häiriöproteiini, jonka amyloidiaggregaatio on liitetty Alzheimerin tautiin10, mutta se on äskettäin liitetty Parkinsonin tautiin (PD) ja muihin synaptisiin ydinproteinopatioihin 11, 12, 13 liittyvät.Taun on osoitettu erottuvan spontaanisti liuoksesta/sytoplasmasta suotuisten sähköstaattisten vuorovaikutusten vuoksi14, mikä johtaa tau-rikasteisten pisaroiden muodostumiseen, jotka tunnetaan sähköstaattisina koaservaatteina.On myös havaittu, että tämäntyyppinen epäspesifinen vuorovaikutus on liikkeellepaneva voima monien biomolekyylien kondensaattien takana luonnossa15.Tau-proteiinin tapauksessa sähköstaattinen aggregaatio voidaan muodostaa yksinkertaisella aggregaatiolla, jossa proteiinin vastakkaisesti varautuneet alueet laukaisevat katkaisuprosessin, tai kompleksisella aggregaatiolla vuorovaikutuksen kautta negatiivisesti varautuneiden polymeerien, kuten RNA:n, kanssa.
Äskettäin α-synukleiini (αS), amyloidi IDP, joka liittyy PD:hen ja muihin neurodegeneratiivisiin sairauksiin, jotka tunnetaan yhteisesti synukleinopatiana17,18, on osoitettu solu- ja eläinmalleissa19,20 keskittyneenä proteiinikondensaatteihin, joilla on nestemäinen käyttäytyminen.In vitro -tutkimukset ovat osoittaneet, että αS käy läpi LLPS:n yksinkertaisella aggregaatiolla pääasiassa hydrofobisten vuorovaikutusten kautta, vaikka tämä prosessi vaatii poikkeuksellisen korkeita proteiinipitoisuuksia ja epätyypillisen pitkiä inkubaatioaikoja19,21.Se, muodostuvatko in vivo havaitut αS:tä sisältävät kondensaatit tässä vai muissa LLPS-prosesseissa, on edelleen ratkaisematon kysymys.Vastaavasti, vaikka αS-amyloidiaggregaatiota on havaittu neuroneissa PD:ssä ja muissa synukleinopatioissa, tarkka mekanismi, jolla αS käy läpi solunsisäisen amyloidiaggregaation, jää epäselväksi, koska tämän proteiinin yli-ilmentyminen ei näytä laukaisevan tätä prosessia itsestään.Usein tarvitaan lisää soluvaurioita, mikä viittaa siihen, että solunsisäisten αS-amyloidikokoonpanojen uudelleentumaan tarvitaan tiettyjä solupaikkoja tai mikroympäristöjä.Yksi soluympäristö, joka on erityisen altis aggregaatiolle, voi olla proteiinikondensaattien sisäosa 23 .
Mielenkiintoista on, että αS:n ja tau:n on havaittu lokalisoituvan yhdessä Parkinsonin tautia ja muita synukleinopatioita sairastavilla ihmisillä 24,25 ja kokeet ovat raportoineet synergistisen patologisen suhteen näiden kahden proteiinin välillä 26,27, mikä viittaa mahdolliseen yhteyteen αS:n ja aggregaation välillä. tau neurodegeneratiivisissa sairauksissa.sairaus.αS:n ja tau:n on havaittu olevan vuorovaikutuksessa ja edistävän toistensa aggregaatiota in vitro ja in vivo 28,29 ja näistä kahdesta proteiinista koostuvia heterogeenisiä aggregaatteja on havaittu potilaiden aivoissa, joilla on synukleinopatia 30 .αS:n ja tau:n välisen vuorovaikutuksen molekyyliperustasta ja sen yhteisaggregaation mekanismista tiedetään kuitenkin vähän.αS:n on raportoitu olevan vuorovaikutuksessa tau:n kanssa sähköstaattisen vetovoiman kautta αS:n erittäin negatiivisesti varautuneen C-terminaalisen alueen ja taun keskeisen proliinirikkaan alueen välillä, joka on myös rikastunut positiivisesti varautuneilla tähteillä.
Tässä tutkimuksessa osoitamme, että αS voi todellakin dissosioitua pisaroiksi sähköstaattisen kompleksisen kondensaation kautta tau-proteiinin läsnä ollessa, toisin kuin sen vuorovaikutuksessa muiden positiivisesti varautuneiden polypeptidien, kuten poly-L-lysiinin (pLK), kanssa ja tässä prosessissa .αS toimii telinemolekyylinä pisaraverkostolle.Olemme tunnistaneet huomattavia eroja sähköstaattisten αS-koaservaattien kypsymisprosessissa, jotka liittyvät eroihin koaservaattiverkostoon osallistuvien proteiinien vuorovaikutuksen valenssissa ja voimakkuudessa.Mielenkiintoista on, että havaitsimme αS- ja tau-amyloidiproteiinien yhteisaggregaatiota pitkäikäisissä nestemäisissä koaservaateissa ja tunnistimme joitain avaintekijöitä, jotka johtavat näiden kahden proteiinin yhteisaggregaatioon sellaisissa koaservaateissa.Tässä kuvaamme yksityiskohtaisesti tätä prosessia, joka on mahdollinen molekyylimekanismi, joka on kahden proteiinin kolokalisoitumisen taustalla sairausspesifisissä inkluusioissa.
αS:llä on erittäin anioninen C-terminaalinen häntä neutraalissa pH:ssa (kuvio 1a), ja oletimme, että se voisi läpikäydä LLPS:n kondensoitumalla sähköstaattisten kompleksien kanssa polykationisten epäjärjestyneiden polypeptidimolekyylien kanssa.Käytimme 100-tähteistä poly-L-lysiiniä (pLK) lähtömallimolekyylinä sen positiivisesti varautuneen ja epäjärjestyneen polymeerisen luonteen vuoksi neutraalissa pH:ssa 32. Ensin vahvistimme, että pLK on vuorovaikutuksessa aS:n Ct-domeenin kanssa liuos-NMR-spektroskopian avulla. (kuvio 1b) käyttämällä 13C/15N-leimattua aS:a kasvavien aS:pLK-moolisuhteiden läsnä ollessa.pLK:n vuorovaikutus aS:n Ct-domeenin kanssa ilmenee kemiallisen siirtymän häiriöinä ja huipun intensiteetin vähenemisenä tällä proteiinin alueella.Mielenkiintoista on, että kun sekoitimme αS:n pLK:n kanssa αS-pitoisuudella noin.5–25 µM polyetyleeniglykolin (5–15 % PEG-8) läsnä ollessa (tyypillinen LLPS-puskuri: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15 % PEG-8) kävimme heti läpi laajan proteiininmuodostuskentän .pisaroita havaittiin käyttämällä fluoresenssi- (WF) ja kirkaskenttämikroskopiaa (BF) (kuvio 1c).1-5 µm pisaroita, jotka sisältävät väkevää αS:ää (lisätty 1 µM AlexaFluor488-leimattua αS, AF488-αS), niiden sähköstaattiset ominaisuudet voidaan johtaa niiden kestävyydestä 10 % 1,6-heksaanidiolia (1,6-HD) vastaan ​​ja sen herkkyydestä NaCl-pitoisuuden nousu (kuvio 1c).αS/pLK-sähköstaattisen kompleksin koaservaattien nestemäisen luonteen osoittaa niiden kyky sulautua millisekunnissa (kuvio 1d).Sameusmittauksella määritimme pisaroiden muodostumisen näissä olosuhteissa, vahvistimme sen stabiilisuuteen liittyvän päävuorovaikutuksen sähköstaattisen luonteen (kuva 1e) ja arvioimme erilaisten polymeerisuhteiden vaikutusta LLPS-prosessiin (kuva 1f).Vaikka pisaroiden muodostumista havaitaan laajalla polymeerisuhteiden alueella, prosessi on erittäin edullinen, kun pLK on yli aS.LLP:itä on myös havaittu käyttämällä kemiallisesti erilaista syrjäyttävää ainetta dekstraani-70 (70 kDa) tai käyttämällä erilaisia ​​näyteformaatteja, mukaan lukien lasitipat, eri materiaaleista valmistetut mikrolevykuopat, Eppendorf- tai kvartsikapillaarit.
kaavamainen esitys eri proteiinialueista tässä tutkimuksessa käytetyissä WT-αS- ja ΔCt-αS-varianteissa.Amfipaattinen N-terminaalinen domeeni, hydrofobinen amyloidia muodostava (NAC) alue ja negatiivisesti varautunut C-terminaalinen domeeni on esitetty sinisenä, oranssina ja punaisena, vastaavasti.WT-αS:n nettoveloitus per jäännös (NCPR) -kartta näytetään.b NMR-analyysi aS/pLK-vuorovaikutuksesta ilman makromolekyylipaakkuja.Kun pLK-pitoisuus kasvaa (aS:pLK-moolisuhteet 1:0,5, 1:1,5 ja 1:10 esitetään vastaavasti vaaleanvihreänä, vihreänä ja tummanvihreänä).c Koaservoi αS/pLK (moolisuhde 1:10) pitoisuudessa 25 µM (1 µM AF488-leimattu αS tai Atto647N-leimattu pLK WF-kuvaukseen) LLPS-puskurissa (ylhäällä) tai täydennettynä 500 mM NaCl:lla (10 alhaalla) tai sen jälkeen % 1,6-heksaanidioli (1,6-HD; alhaalla oikealla).Mittakaava = 20 µm.d Edustavat mikroskooppiset kuvat αS/pLK:n BF-pisarafuusion (moolisuhde 1:10) pitoisuudella 25 µM;nuolet osoittavat yksittäisten pisaroiden (punaiset ja keltaiset nuolet) sulautumisen uudeksi pisaroksi (oranssi nuoli) 200 ms:n sisällä.Mittakaava = 20 µm.e Valonsironta (350 nm:ssä) αS/pLK-aggregaatio LLPS-puskurissa ennen ja jälkeen 500 mM NaCl:n tai 10 % 1,6-HD:n lisäämisen pitoisuudessa 25 µM αS (N = 3 näytetoistoa, myös keskiarvo ja standardipoikkeama on ilmoitettu).f BF-kuva (ylhäällä) ja valonsirontaanalyysi (350 nm:ssä, alhaalla) αS/pLK-aggregaatiosta 25 μM αS:ssä αS:pLK-moolisuhteen kasvaessa (N = 3 näytetoistoa, myös keskiarvo ja keskihajonta on ilmoitettu).Mittakaavapalkki = 10 µm.Yhden kuvan mittakaavapalkki osoittaa kaikkien kuvien mittakaavan yhdessä paneelissa.Raakadata toimitetaan raakadatatiedostoina.
Perustuen havaintoihin αS/pLK sähköstaattisen kompleksin kondensaatiosta ja aikaisempien havaintojen perusteella αS:stä tau/RNA-kondensaatin asiakasmolekyylinä suoran vuorovaikutuksen kautta tau31:n kanssa, oletimme, että αS ja tau voisivat segregoitua yhdessä liuottimen kanssa ilman RNA:ta. tiivistyminen.sähköstaattisten kompleksien kautta, ja αS on scaffold-proteiini αS/Tau-koaservaateissa (katso tau-varauksen jakautuminen kuvassa 2e).Havaitsimme, että kun 10 μM αS ja 10 μM Tau441 (sisältävät 1 μM AF488-αS ja 1 μM Atto647N-Tau, vastaavasti) sekoitettiin yhteen LLPS-puskurissa, ne muodostivat helposti proteiiniaggregaatteja, jotka sisälsivät molemmat proteiinit, kuten WF-mikroskoopilla havaittiin.(kuvio 2a).Kahden proteiinin kolokalisaatio pisaroissa varmistettiin konfokaalisella (CF) mikroskopialla (täydentävä kuva 1a).Samanlainen käyttäytyminen havaittiin, kun dekstraani-70:tä käytettiin aggregaatioaineena (täydentävä kuva 1c).Käyttämällä joko FITC-leimattua PEG:tä tai dekstraania, havaitsimme, että molemmat tiivistysaineet jakautuivat tasaisesti näytteille, eivätkä ne osoittaneet erottelua tai assosiaatiota (täydentävä kuva 1d).Pikemminkin se viittaa siihen, että tässä järjestelmässä ne edistävät faasien erottelua makromolekyylien tiivistymisvaikutusten kautta, koska PEG on ensisijaisesti stabiili tiivistysaine, kuten muissa LLP-järjestelmissä nähdään33,34.Nämä proteiinipitoiset pisarat olivat herkkiä NaCl:lle (1 M), mutta eivät 1,6-HD:lle (10 % tilavuus/tilavuus), mikä vahvistaa niiden sähköstaattiset ominaisuudet (lisäkuvat 2a, b).Niiden nestekäyttäytyminen varmistettiin tarkkailemalla millisekunnin sulavia pisaroita BF-mikroskopiaa käyttämällä (kuva 2b).
a Konfokaaliset (CF) mikroskopiakuvat αS/Tau441-koaservaateista LLPS-puskurissa (10 μM kutakin proteiinia, 0,5 μM AF488-leimattua αS:tä ja Atto647N-leimattua Tau441:tä).b Edustavia differentiaalihäiriökontrasti (DIC) -kuvia αS/Tau441-pisaroiden fuusiotapahtumista (10 μM kullekin proteiinille).c Vaihekaavio, joka perustuu Tau441 LLPS:n (0–15 µM) valonsirontaan (350 nm:ssä) 50 µM αS:n puuttuessa (vasemmalla) tai läsnä ollessa (oikealla).Lämpimät värit osoittavat enemmän sirontaa.d αS/Tau441 LLPS -näytteiden valon sironta αS-pitoisuuden kasvaessa (Tau441 pitoisuudessa 5 µM, N = 2–3 näytetoistoa ohjeiden mukaisesti).e Kaavioesitys joistakin tässä tutkimuksessa käytetyistä tau-proteiinivarianteista ja proteiinin eri alueista: negatiivisesti varautunut N-terminaalinen domeeni (punainen), runsaasti proliinia sisältävä alue (sininen), mikrotubuluksia sitova domeeni (MTBD, korostettu oranssilla) ja amyloidia muodostava parispiraali.filamenttialueet (PHF), jotka sijaitsevat MTBD:ssä (harmaa).Tau441:n nettoveloitus jäännöskohtainen (NCPR) -kartta näytetään.f Käyttäen 1 µM AF488-leimattua αS- ja Atto647N-leimattua ΔNt-:tä, käyttämällä 1 µM AF488-leimattua αS:tä tai ΔCt-αS:a ΔNt-Tau:n läsnä ollessa (yläosa, 10 µM per proteiini, tai K15 µM per proteiini ) ) ) mikrokuvat WF:stä, joka on tiivistetty LLPS- tai K18-puskuriin.Yhden kuvan mittakaavapalkit edustavat kaikkien kuvien mittakaavaa yhdessä paneelissa (20 µm paneeleille a, b ja f).Paneeleiden c ja d raakatiedot toimitetaan raakadatatiedostoina.
Testaaksemme αS:n roolia tässä LLPS-prosessissa, tutkimme ensin αS:n vaikutusta pisaroiden stabiilisuuteen nefelometrialla käyttämällä NaCl:n kasvavia pitoisuuksia (kuva 2c).Mitä korkeampi suolapitoisuus on αS:tä sisältävissä näytteissä, sitä korkeammat ovat valonsirontaarvot (350 nm:ssä), mikä osoittaa αS:n stabiloivan roolin tässä LLPS-järjestelmässä.Samanlainen vaikutus voidaan havaita nostamalla αS-konsentraatiota (ja siten αS:Tau441-suhdetta) noin.10-kertainen lisäys tau-pitoisuuteen (5 uM) verrattuna (kuvio 2d).Osoittaaksemme, että αS on telineproteiini koaservaateissa, päätimme tutkia LLPS-häiriöisen Tau-mutantin käyttäytymistä, josta puuttuu negatiivisesti varautunut N-terminaalinen alue (tähteet 1–150, katso kuva 2e), jota kutsutaan nimellä ΔNt-Tau.WF-mikroskopia ja nefelometria vahvistivat, että ΔNt-Tau itse ei käynyt läpi LLPS:ää (kuva 2f ja täydentävä kuva 2d), kuten aiemmin on raportoitu 14. Kuitenkin, kun αS lisättiin tämän typistetyn Tau-variantin dispersioliuoksiin, LLPS-prosessi oli täysin palautettiin pisaratiheydellä, joka on lähellä Tau- ja αS:n täysikokoisten liuosten pisaratiheyttä samanlaisissa olosuhteissa ja proteiinipitoisuuksissa.Tämä prosessi voidaan havaita myös olosuhteissa, joissa makromolekyylien tiivistyminen on vähäistä (täydentävä kuva 2c).C-terminaalisen αS-alueen, mutta ei sen koko pituuden, rooli LLPS-prosessissa osoitettiin estämällä pisaroiden muodostumista käyttämällä C-terminaalista katkaistua αS-varianttia, josta puuttui (ΔCt-) tähteet 104–140 (kuva 1a). αS) -proteiini (kuvio 2f ja täydentävä kuva 2d).αS:n ja ΔNt-Tau:n kolokalisaatio vahvistettiin konfokaalisella fluoresenssimikroskopialla (täydentävä kuva 1b).
Tau441:n ja αS:n välisen LLPS-mekanismin testaamiseksi edelleen käytettiin Tau-lisävarianttia, nimittäin paritettua helical filament core (PHF) -fragmenttia mikrotubuluksia sitovassa domeenissa (MTBD). kuin K18-fragmentti (katso kuvio 2e).Äskettäin on raportoitu, että aS sitoutuu ensisijaisesti tau-proteiiniin, joka sijaitsee runsaasti proliinia sisältävässä domeenissa sekvenssissä, joka edeltää mikrotubuluksia sitovaa domeenia.PHF-alueella on kuitenkin myös runsaasti positiivisesti varautuneita tähteitä (katso kuva 2e), erityisesti lysiiniä (15 % tähteitä), mikä sai meidät testaamaan, vaikuttaako tämä alue myös αS/Tau-kompleksin kondensaatioon.Havaitsimme, että K18 ei yksinään kyennyt laukaisemaan LLPS:ää pitoisuuksilla 100 µM asti testatuissa olosuhteissa (LLPS-puskuri, jossa on 15 % PEG:tä tai 20 % dekstraania) (kuva 2f).Kuitenkin, kun lisäsimme 50 µM αS 50 µM K18:aan, K18:aa ja αS:a sisältävien proteiinipisaroiden nopea muodostuminen havaittiin nefelometrialla (lisäkuva 2d) ja WF-mikroskopialla (kuva 2f).Kuten odotettiin, ACt-aS ei kyennyt palauttamaan K18:n LLPS-käyttäytymistä (kuvio 2f).Huomaa, että αS/K18-aggregaatio vaatii hieman korkeampia proteiinipitoisuuksia LLPS:n indusoimiseksi verrattuna αS/ΔNt-Tau- tai αS/Tau441-proteiiniin, muiden asioiden ollessa samat.Tämä on yhdenmukainen aS C-terminaalisen alueen vahvemman vuorovaikutuksen kanssa proliinirikkaan Tau-domeenin kanssa verrattuna mikrotubuluksia sitovaan domeeniin, kuten aiemmin on kuvattu 31 .
Ottaen huomioon, että ΔNt-Tau ei voi suorittaa LLPS:ää αS:n puuttuessa, valitsimme tämän Tau-muunnelman malliksi αS / Tau LLPS:n karakterisoimiseksi, koska se on yksinkertaista LLPS-järjestelmissä, joissa on täyspitkä Tau (isotyyppi, Tau441/Tau441).monimutkaisilla (heterotyyppisillä, αS/Tau441) aggregaatioprosesseilla.Vertasimme αS-aggregaation astetta (osana kondensoitunutta faasiproteiinia, fαS,c) αS/Tau- ja αS/ΔNt-Tau-järjestelmissä sentrifugoinnilla ja dispergoituneen faasin SDS-PAGE-analyysillä (katso 2e) ja löysimme hyvin samanlaisia ​​arvoja. kaikille proteiineille samalla pitoisuudella.Erityisesti saimme fαS,c 84 ± 2 % ja 79 ± 7 % αS/Tau:lle ja αS/ΔNt-Taulle, vastaavasti, mikä viittaa siihen, että heterotyyppinen vuorovaikutus aS:n ja taun välillä on parempi kuin tau-molekyylien välinen vuorovaikutus.välillä.
Vuorovaikutusta eri polykationien kanssa ja kondensaatioprosessin vaikutusta αS-kinetiikkaan tutkittiin ensin valovalkaisun jälkeisellä fluoresenssin talteenottomenetelmällä (FRAP).Testasimme αS/Tau441-, αS/ΔNt-Tau- ja αS/pLK-koaservaatteja (100 μM αS täydennettynä 2 μM αS AF488-αS:llä ja 100 μM Tau441:llä tai ΔNt-MLK p- tai ΔNt-Tau tai).Tiedot saatiin ensimmäisten 30 minuutin aikana näytekomponenttien sekoittamisen jälkeen.Edustavista FRAP-kuvista (kuva 3a, αS/Tau441-kondensaatio) ja niitä vastaavista aikakäyristä (kuva 3b, täydentävä kuva 3), voidaan nähdä, että αS-kinetiikka on hyvin samankaltainen kuin Tau441-koaservaattien.ja ΔNt-Tau, joka on paljon nopeampi pLK:n kanssa.Lasketut diffuusiokertoimet koaservaatin sisällä olevalle αS:lle FRAP:n mukaisesti (kuten Kang et al. 35 ovat kuvanneet) ovat D = 0,013 ± 0,009 µm2/s ja D = 0,026 ± 0,008 µm2/s αS/Tau4-ΔtN:lle αS/-järjestelmä.pLK, Tau ja D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, vastaavasti (kuvio 3c).Kuitenkin diffuusiokerroin αS dispergoituneessa faasissa on useita suuruusluokkia suurempi kuin kaikki kondensoituneet faasit määritettynä fluoresenssikorrelaatiospektroskopialla (FCS, katso täydentävä kuva 3) samoissa olosuhteissa (LLPS-puskuri), mutta polykationien puuttuessa. (D = 8 ± 4 µm2/s).Siksi αS-translaation kinetiikka on merkittävästi heikentynyt koaservaateissa verrattuna proteiineihin dispergoituneessa faasissa johtuen voimakkaista molekyylien tiivistymisvaikutuksista, vaikka kaikki koaservaatit säilyttävät nestemäiset ominaisuudet ensimmäisen puolen tunnin aikana muodostumisen jälkeen, toisin kuin tau-faasi.nopeampi kinetiikka pLK-kondensaatissa.
a–c FRAP-analyysi αS-dynamiikasta (2 % AF488-leimattu αS) sähköstaattisissa koaservaateissa.Edustavia kuvia αS/Tau441 FRAP-määrityksistä kolmena rinnakkaisena on esitetty kohdassa (a), jossa punaiset ympyrät osoittavat värittyneet alueet.Asteikkopalkki on 5 µm.b Keskimääräiset FRAP-käyrät ja (c) lasketut diffuusiokertoimet (D) 5–6 (N) eri pisaralle kolmesta kokeesta käyttäen 100 µM αS ja Tau441 (punainen) tai ΔNt-Tau (sininen) tai pLK (vihreä) ekvimolaarisia pitoisuuksia kymmenen kertaa LLPS:n pitoisuus.FRAP-käyrän keskihajonta näytetään varjostettuna.Vertailun vuoksi diffuusiokerroin αS dispergoidussa faasissa määritettiin kolmena rinnakkaisena käyttämällä fluoresenssikorrelaatiospektroskopiaa (FCS) (katso lisäkuva 3 ja menetelmät saadaksesi lisätietoja).d Jatkuvat X-kaistan EPR-spektrit 100 μM TEMPOL-122-αS:stä LLPS-puskurissa ilman polykationia (musta) tai kun läsnä on 100 μM Tau441 (punainen) tai ΔNt-Tau (sininen) tai 1 mM pLK (vihreä).Upote näyttää suurennettuna näkymän voimakkaista kenttäviivoista, joissa tapahtuu dramaattisimmat muutokset.e 50 μM TEMPOL-122-αS:n sitoutumiskäyrät erilaisilla polykationeilla ilman LLPS:ää (ei PEG:tä).Kaistan III pienentyneen amplitudin verrattuna normalisoidun EPR-spektrin vyöhykkeeseen II (IIII/III) on osoitettu lisäävän Tau441:n (punainen), ΔNt-Tau:n (sininen) ja pLK:n (vihreä) moolisuhteita.Värilliset viivat osoittavat sopivuuden dataan käyttämällä karkeaa sitoutumismallia, jossa on n identtistä ja riippumatonta sitoutumiskohtaa kussakin käyrässä.Raakadata toimitetaan raakadatatiedostoina.
Täydennyksenä tutkimme αS:n dynamiikkaa erilaisissa koaservaateissa käyttämällä suunnattua spin-leimausta (SDSL) ja jatkuvaa elektroniparamagneettista resonanssia (CW-EPR).Tämä menetelmä on osoittautunut erittäin hyödylliseksi raportoitaessa IDP:n joustavuutta ja dynamiikkaa realistisella jäännösresoluutiolla36,37,38.Tätä tarkoitusta varten rakensimme kysteiinijäännöksiä yksittäisissä Cys-mutanteissa ja käytimme 4-hydroksi-2,2,6,6-tetrametyylipiperidiini-N-oksyyli (TEMPOL) spin-koetinta.Maleimidijohdannaiset merkitsevät ne.Tarkemmin sanottuna lisäsimme TEMPOL-koettimet kohtaan 122 tai 24 αS (TEMPOL-122-αS ja TEMPOL-24-αS).Ensimmäisessä tapauksessa kohdistamme proteiinin C-terminaalisen alueen, joka on osallisena vuorovaikutuksessa polykationien kanssa.Sen sijaan sijainti 24 voi antaa meille tietoa kondensaatin proteiinien yleisestä dynamiikasta.Molemmissa tapauksissa dispergoituneen faasin proteiineille saadut EPR-signaalit vastasivat nopeasti liikkuvia nitroksidiradikaaleja.Tau:n tai pLK:n (100 µM TEMPOL-αS, Tau441 tai ΔNt-Tau suhteessa 1:1 tai pLK suhteessa 1:10) läsnäollessa suoritetun faasierottamisen jälkeen havaittiin suhteellisen huipun intensiteetin nousu αS:n EPR-spektri.Häviöviiva leveni osoittaen vähentyneen αS:n uudelleensuuntautumiskinetiikkaa pisaroissa verrattuna proteiiniin laimeassa vaiheessa (kuva 3d, täydentävä kuva 4a).Nämä muutokset ovat selvempiä kohdassa 122. Vaikka kohdassa 24 pLK:n läsnäolo ei vaikuttanut koettimen kinetiikkaan, kohdassa 122 spektriviivan muoto muuttui merkittävästi (täydentävä kuva 4a).Kun yritimme mallintaa kahden αS/polykationijärjestelmän spektrejä kohdassa 122 käyttämällä isotrooppista mallia (lisäkuva 5a), jota käytetään yleisesti kuvaamaan spin-leimatun IDP38,39:n dynamiikkaa, emme pystyneet rekonstruoimaan kokeellisia spektrejä..Spektrisimulaatio 24 spinin kontrastin sijainnista (lisäkuva 5a).Tämä viittaa siihen, että αS:n C-terminaalisen alueen spin-konfiguraatioiden avaruudessa on edullisia paikkoja polykationien läsnä ollessa.Kun otetaan huomioon αS:n osuus kondensoidussa faasissa kokeellisissa EPR-olosuhteissa (84 ± 2 %, 79 ± 7 % ja 47 ± 4 % αS/Tau441:lle, αS/ΔNt-Tau:lle ja αS/pLK:lle, vastaavasti – katso lisäosa Data-analyysin c) kuva 2e, voidaan nähdä, että EPR-menetelmällä havaittu laajeneminen heijastaa pääasiassa αS:n C-terminaalisen alueen vuorovaikutusta erilaisten polykationien kanssa kondensoituneessa faasissa (päämuutos käytettäessä TEMPOL-122- αS), ei proteiinien kondensaatiota.Mikroviskositeetin kasvua havaitaan koettimessa.Kuten odotettiin, proteiinin EPR-spektri muissa olosuhteissa kuin LLPS:ssä palautui täysin, kun seokseen lisättiin 1 M NaCl (täydentävä kuva 4b).Kaiken kaikkiaan tietomme viittaavat siihen, että CW-EPR:n havaitsemat muutokset heijastavat pääasiassa αS:n C-terminaalisen alueen vuorovaikutusta erilaisten polykationien kanssa kondensoituneessa faasissa, ja tämä vuorovaikutus näyttää olevan vahvempi pLK:n kanssa kuin Taun kanssa.
Saadaksemme lisää rakenteellista tietoa koaservaatin proteiineista, päätimme tutkia LLPS-järjestelmää käyttämällä NMR:ää liuoksessa.Pystyimme kuitenkin havaitsemaan vain dispergoituneeseen faasiin jääneen αS-fraktion, mikä voi johtua vähentyneestä proteiinidynamiikasta koaservaatin sisällä ja tiheästä faasista liuoksen pohjassa NMR-analyysissä.Kun analysoimme LLPS-näytteen dispergoituneeseen faasiin jääneen proteiinin rakennetta ja dynamiikkaa NMR:n avulla (lisäkuva 5c, d), huomasimme, että proteiini käyttäytyi lähes identtisesti pLK:n ja ΔNt-Tau:n läsnä ollessa. jotka olivat proteiinirungon toissijaisessa rakenteessa ja dynamiikassa, mikä paljastui sekundaarista kemiallista siirtymää ja R1ρ-relaksaatiota koskevissa kokeissa.NMR-tiedot osoittavat, että aS:n C-pää kärsii merkittävästä konformationaalisen joustavuuden menetyksestä säilyttäen samalla epäjärjestyneen luonteensa, kuten muun proteiinisekvenssin, johtuen sen vuorovaikutuksista polykationien kanssa.
Koska TEMPOL-122-αS:n kondensoituneessa faasissa havaittu CW-EPR-signaalin laajeneminen heijastaa proteiinin vuorovaikutusta polykationien kanssa, suoritimme EPR-titrauksen arvioidaksemme αS:n sitoutumisaffiniteettia erilaisiin polykationeihin LLPS:n puuttuessa (ei kertymistä Puskuri LLPS), mikä viittaa siihen, että vuorovaikutukset ovat samat laimeassa ja väkevöidyssä faasissa (jonka vahvistavat tietomme, täydentävä kuva 4a ja täydentävä kuva 6).Tavoitteena oli nähdä, osoittavatko kaikki koaservaatit niiden yhteisistä nestemäisistä ominaisuuksista huolimatta mitään taustalla olevaa eroavaa käyttäytymistä molekyylitasolla.Kuten odotettiin, EPR-spektri laajeni lisääntyvän polykationipitoisuuden myötä, mikä heijastaa molekyylin joustavuuden laskua, joka johtuu kaikkien vuorovaikutuskumppanien molekyylien vuorovaikutuksista melkein kyllästymiseen asti (kuva 3e, täydentävä kuva 6).pLK saavutti tämän kyllästymisen pienemmällä moolisuhteella (polykationi:aS) verrattuna ΔNt-Tau:hen ja Tau441:een.Itse asiassa tietojen vertailu likimääräiseen sitoutumismalliin, jossa oletetaan n identtistä ja riippumatonta sitoutumiskohtaa, osoitti, että pLK:n näennäinen dissosiaatiovakio (~5 μM) on suuruusluokkaa pienempi kuin Tau441:n tai ΔNt-Tau:n (~50 μM). ).µM).Vaikka tämä on karkea arvio, tämä viittaa siihen, että αS:llä on suurempi affiniteetti yksinkertaisempiin polykationeihin, joissa on jatkuvat positiiviset varausalueet.Ottaen huomioon tämän eron αS:n ja eri polykationien välillä, oletimme, että niiden nesteominaisuudet voivat muuttua eri tavalla ajan myötä ja kärsiä siten erilaisista LSPT-prosesseista.
Ottaen huomioon proteiinin koaservaatin erittäin ruuhkaisen ympäristön ja proteiinin amyloidisen luonteen, tarkkailimme koaservaatin käyttäytymistä ajan mittaan mahdollisten LSPT-prosessien havaitsemiseksi.Käyttämällä BF- ja CF-mikroskopiaa (kuva 4) havaitsimme, että αS/Tau441 koaservoituu suuressa määrin liuoksessa muodostaen suuria pisaroita, jotka koskettavat ja kostuttavat kaivon/liukun pohjan pintaa täysinä pisareina, kuten odotettiin (täydentävä kuva 4). 7d);kutsumme näitä pohjamuotoisia rakenteita "proteiinilautiksi".Nämä rakenteet pysyivät nestemäisinä, koska ne säilyttivät kykynsä sulautua (lisäkuva 7b) ja niitä voitiin nähdä useita tunteja LLPS:n laukaisun jälkeen (kuva 4 ja täydentävä kuva 7c).Havaitsimme, että kostutusprosessi suosii hydrofiilisten kuin hydrofobisten materiaalien pinnalla (täydentävä kuva 7a), kuten odotettiin sähköstaattisille koaservaateille, joilla on epätasapainoiset varaukset ja siten korkeat sähköstaattiset pintapotentiaalit.Erityisesti αS/ΔNt-Tau-yhtymä ja koskenlasku vähenivät merkittävästi, kun taas aS/pLK-kondensaatit vähenivät merkittävästi (kuvio 4).Lyhyen inkubaatioajan aikana αS/pLK-pisarat kykenivät sulautumaan yhteen ja kostuttamaan hydrofiilisen pinnan, mutta tämä prosessi pysähtyi nopeasti ja 5 tunnin inkubaation jälkeen havaittiin vain rajoitettuja yhteensulautumistapahtumia eikä kostutusta.– geeli-tippusiirtymä.
Edustavat BF (harmaasävypaneelit) ja CF (oikeat paneelit, AF488-leimattu αS vihreänä) koaservaattinäytteistä, jotka sisältävät 100 µM αS (1 % fluoresoiva leima) LLPS-puskurissa 100 µM Tau441 (ylä) mikrofluoresenssikuvien läsnä ollessa. -Tau (keskellä) tai 1 mM pLK (alhaalla) eri inkubaatioajoilla ja polttokorkeuksilla (z, etäisyys levykuopan pohjasta).Kokeet toistettiin 4-6 kertaa toisistaan ​​riippumatta samoilla tuloksilla.αS/Tau441-koaservaatit kastuvat 24 tunnin kuluttua, jolloin muodostuu kuvaa suurempia lauttoja.Kaikkien kuvien mittakaava on 20 µm.
Sitten kysyimme, johtaisiko αS/Tau441 LLPS:ssä muodostuneet suuret nestemäiset proteiinipoolit minkä tahansa tutkitun proteiinin amyloidiaggregaatioon.Seurasimme αS/Tau441-pisaroiden kypsymistä ajan myötä WF-mikroskopialla samoissa olosuhteissa kuin yllä, mutta käyttämällä 1 µM AF488-leimattua αS:tä ja Atto647N-leimattua Tau441:tä (kuva 5a).Kuten odotettiin, havaitsimme täydellisen proteiinin lokalisoitumisen koko kypsymisprosessin ajan.Mielenkiintoista, n.Viiden tunnin kuluttua lauttojen sisällä havaittiin voimakkaampia ei-pyöreitä rakenteita, joita kutsuimme "pisteiksi", joista osa oli kolokalisoitunut αS:llä ja osa rikastui Tau441:llä (kuva 5a, valkoiset nuolet).Näitä täpliä on aina havaittu lautoissa enemmän αS/ΔNt-Taulle kuin αS/ΔNt-Taulle.PLK- ja Tau-järjestelmien pisaroissa ei ollut selkeitä täpliä, jotka eivät olleet päteviä fuusio/kostutukseen.Testataksemme, ovatko nämä αS:tä ja Tau441:tä sisältävät värjäykset amyloidin kaltaisia ​​aggregaatteja, suoritimme samanlaisen kokeen CF-mikroskoopilla, jossa Tau441 leimattiin Atto647N:llä ja 12,5 µM amyloidispesifistä tioflaviini-T:tä (ThT) lisättiin alusta alkaen.väriaine.Vaikka αS/Tau441-pisaroiden tai lauttojen ThT-värjäytymistä ei havaittu edes 24 tunnin inkubaation jälkeen (kuvio 5b, ylärivi - jäljellä olevat pisarat proteiinilauttojen päällä), ThT-positiiviset rakenteet, jotka sisälsivät Atto647N-Tau441:tä lauttojen sisällä, olivat erittäin heikkoja.tämä toistaa aiemmin kuvattujen täplien koon, muodon ja sijainnin (kuvio 5b, keski- ja alarivit), mikä viittaa siihen, että täplät voivat vastata amyloidin kaltaisia ​​aggregaatteja, jotka muodostuvat ikääntyvän nesteen koaservaateissa.
WF 25 μM αS eri inkubaatioajoilla ja polttokorkeuksilla (z, etäisyys sitoutumattomasta pohjasta) 25 μM Tau441:n (1 μM AF488-leimattu αS ja Atto647N-leimattu Tau441) läsnä ollessa LLPS-puskurilevyn kuopassa) .Kuusi koetta toistettiin itsenäisesti samanlaisilla tuloksilla.b CF-mikroskooppinen kuva 25 μM αS:stä, kun läsnä on 25 μM Tau441:tä (1 μM Atto647N-leimattu Tau441) ja 12,5 μM tioflaviini-T:tä (ThT).Painotetut proteiinipisarat ja kerrostuneet proteiinilautat ja -täplät näkyvät ylä- ja keskirivillä, vastaavasti.Alimmalla rivillä on kuvia lautoista ja pudotuksista kolmesta itsenäisestä kopiosta.Valkoiset nuolet osoittavat ThT-positiivisia pisteitä molemmissa paneeleissa.Kaikkien kuvien mittakaava on 20 µm.
Tarkastellaksemme yksityiskohtaisemmin koaservaattiproteiiniverkoston muutoksia nestemäisestä kiinteään tilaan siirtymisen aikana käytimme fluoresenssielinaikakuvausta (FLIM) ja Försterin resonanssienergiansiirtomikroskopiaa (FRET) (kuva 6 ja täydentävät kuvat 8 ja 9).Oletimme, että kerroksen koaservaattikypsyminen tiivistyneemmäksi tai jopa kiinteämmäksi aggregoituneeksi proteiinirakenteeksi johtaa tiiviimpään kosketukseen proteiinin ja siihen kiinnitetyn fluoresoivan koettimen välillä, mikä mahdollisesti tuottaa sammutusvaikutuksen, joka ilmenee lyhentyneenä koettimen eliniässä (τ) , kuten aiemmin on kuvattu40.,41,42.Lisäksi kaksoisleimattujen näytteiden (AF488 ja Atto647N FRET-luovuttaja- ja akseptoriväreinä, vastaavasti) tähän τ:n laskuun voi liittyä myös koaservaattikondensaatio ja FRET(E)-tehokkuuden kasvu LSPT:n aikana.Seurasimme lauttojen ja täplien muodostumista ajan myötä LLPS-αS/Tau441- ja αS/ΔNt-Tau-näytteissä (25 µM kutakin proteiinia LLPS-puskurissa, joka sisälsi 1 µM AF488-leimattua αS:tä ja/tai Atto647N-leimattua Tau441:tä tai ΔNt-Tau:ta).Havaitsimme yleisen suuntauksen, että AF488 (τ488) ja Atto647N (τ647N) koettimien fluoresenssin elinikä väheni hieman koaservaattien kypsyessä (kuva 6 ja täydentävä kuva 8c).Mielenkiintoista on, että tämä muutos parani merkittävästi lauttojen sisällä olevissa pisteissä (kuvio 6c), mikä osoittaa, että lisäproteiinien kondensaatiota tapahtui pisteissä.Tämän tueksi ei havaittu merkittävää muutosta fluoresenssin eliniässä 24 tuntia vanhentuneilla αS/ΔNt-Tau-pisaroilla (täydentävä kuva 8d), mikä viittaa siihen, että pisaroiden geeliytyminen on prosessi, joka eroaa täplistä ja siihen ei liity merkittävää molekyylien uudelleenjärjestelyä. koacervaattien sisällä.On huomattava, että pisteillä on eri kokoisia ja vaihteleva sisältö αS:ssä, erityisesti αS/Tau441-järjestelmässä (täydentävä kuva 8e).Pistefluoresenssin käyttöiän lyhenemiseen liittyi intensiteetin lisääntyminen, erityisesti Atto647N-leimatun Tau441:n kohdalla (täydentävä kuva 8a), ja korkeammat FRET-tehokkuudet sekä αS/Tau441- että αS/ΔNt-Tau-järjestelmissä, mikä osoittaa kondensaatiota lisää viidessä tunnissa LLPS:ssä. laukaisun jälkeen staattisen sähkön sisällä olevat proteiinit kondensoituivat.Verrattuna αS/ΔNt-Tau-arvoon havaitsimme alhaisempia τ647N- ja jonkin verran korkeampia τ488-arvoja αS/Tau441-pisteissä, joihin liittyi pienempiä ja epähomogeenisempia FRET-arvoja.Mahdollisesti tämä voi liittyä siihen tosiasiaan, että αS/Tau441-järjestelmässä havaittu ja odotettu αS:n runsaus aggregaateissa on heterogeenisempi, usein substoikiometrinen Tautiin verrattuna, koska itse Tau441 voi myös käydä läpi LLPS:n ja aggregaation (täydentävä kuva 8e) .Pisaroiden yhteenliittymisaste, lauttojen muodostuminen ja mikä tärkeintä, proteiinien aggregaatio nestemäisissä koaservaateissa on kuitenkin maksimaalinen, kun sekä Tau441 että αS ovat läsnä.
FLIM-kuvia αS/Tau441:stä ja αS/ΔNt-Tausta 25 μM kutakin proteiinia (1 μM AF488-leimattu αS ja 1 μM Atto647N-leimattu Tau441 tai ΔLL-PSTau-buffer) in.Sarakkeet näyttävät edustavia kuvia LLPS-näytteistä eri kypsytysaikoina (30 min, 5 h ja 24 h).Punainen kehys näyttää alueen, joka sisältää αS/Tau441-pisteitä.Elinajat näkyvät väripalkkeina.Mittakaava = 20 µm kaikille kuville.b Valitun alueen zoomattu FLIM-kuva, joka näkyy punaisessa laatikossa paneelissa a.Elinikärajat esitetään samalla väriasteikolla kuin paneelissa a.Mittakaava = 5 µm.c Histogrammit, jotka näyttävät AF488:n (kiinnitettynä αS:ään) tai Atto647N:n (liittyy Tau:hun) eri proteiinilajeille (pisarat-D-, lautta-R- ja pilkku-P), jotka on tunnistettu FLIM-kuvissa, jotka on tallennettu αS-:lle) ajoitusjakaumien Tau441:n ja αS/ΔNt-Tau koaservaattinäytteet (N = 17-32 ROI D:lle, 29-44 ROI R:lle ja 21-51 ROI pisteille).Keskiarvot ja mediaaniarvot näytetään keltaisina neliöinä ja mustina viivoina laatikoiden sisällä.Laatikon ala- ja ylärajat edustavat ensimmäistä ja kolmatta kvartiilia, ja minimi- ja maksimiarvot 1,5-kertaisella kvartiilialueella (IQR) näkyvät viiksinä.Poikkeamat näkyvät mustina timantteina.Tilastollinen merkitsevyys jakautumaparien välillä määritettiin käyttämällä kahden otoksen t-testiä olettaen, että varianssit eivät ole yhtä suuret.Kaksisuuntaiset t-testin p-arvot on merkitty tähdellä jokaiselle verrattavalle dataparille (* p-arvo > 0,01, ** p-arvo > 0,001, *** p-arvo > 0,0001, **** p-arvo > 0,00001), ns Ilmaisee merkityksettömyyttä (p-arvo > 0,05).Tarkat p-arvot on annettu lisätaulukossa 1, ja alkuperäiset tiedot esitetään raakatietotiedostoina.
Osoittaaksemme edelleen pilkkujen/aggregaattien amyloidimaista luonnetta käsittelimme värjäämättömiä koaservaattinäytteitä 24 tunnin ajan korkeilla (1 M) NaCl-pitoisuuksilla, mikä johti aggregaattien erottumiseen proteiinin koaservaateista.Kun eristettyjä aggregaatteja (eli aggregaattien dispergoitua liuosta) havainnoitiin atomivoimamikroskopiaa (AFM) käyttäen, havaitsimme pääasiassa pallomaisen morfologian, jonka säännöllinen korkeus oli noin 15 nm ja joka pyrkii assosioitumaan olosuhteissa, joissa suolapitoisuus on korkea, samankaltaisesti kuin tyypillisten amyloidifibrillien käyttäytyminen pinnalla olevan voimakkaan hydrofobisen vaikutuksen vuoksi (huomaa, että fibrillien korkeus on tyypillisesti ~10 nm) (täydentävä kuva 10a).Mielenkiintoista on, että kun eristettyjä aggregaatteja inkuboitiin ThT:n kanssa tavanomaisessa ThT-fluoresenssimäärityksessä, havaitsimme dramaattisen kasvun ThT-fluoresenssikvanttisaannossa, joka on verrattavissa siihen, mitä havaittiin, kun väriainetta inkuboitiin tyypillisten αS-amyloidifibrillien kanssa (täydentävä kuva 10b), mikä viittaa siihen, että koaservaattiaggregaatit sisältävät amyloidin kaltaisia ​​rakenteita..Itse asiassa aggregaatit kestivät korkeita suolapitoisuuksia, mutta herkkiä 4 M guanidiinikloridille (GdnHCl), kuten tyypilliset amyloidifibrillit (täydentävä kuva 10c).
Seuraavaksi analysoimme aggregaattien koostumuksen käyttämällä yhden molekyylin fluoresenssia, spesifistä fluoresenssikorrelaatio/ristikorrelaatiospektroskopiaa (FCS/FCCS) ja purskeanalyysiä kahden värin yhteensattuman havaitsemisesta (TCCD).Tätä varten eristimme 24 tunnin inkubaation jälkeen muodostuneita aggregaatteja 100 μl:ssa LLPS-näytteitä, jotka sisälsivät αS:tä ja Tau441:tä (molemmat 25 μM) yhdessä 1 μM AF488-leimatun αS:n ja 1 μM Atto647N-leimatun Tau441:n kanssa.Laimenna saatu dispergoitu aggregaattiliuos monomolekyyliseen tilaan käyttämällä samaa PEG-vapaata puskuria ja 1 M NaCl:a (sama puskuri, jota käytettiin aggregaattien erottamiseen koaservaatista) mahdollisten sähköstaattisten vuorovaikutusten estämiseksi LLPS:n ja proteiinin välillä.Esimerkki yksittäisen molekyylin aikaradasta voidaan nähdä kuviossa 7a.FCCS/FCS-analyysi (ristikorrelaatio, CC ja autokorrelaatio, AC) osoitti, että αS:tä ja tau:ta sisältäviä aggregaatteja oli runsaasti näytteissä (katso CC-käyrä kuvassa 7b, vasen paneeli), ja ylimäärä jäännösmonomeeristä proteiinia syntyi laimennusprosessin tulos (katso AC-käyrät kuvassa 7b, vasen paneeli).Kontrollikokeet, jotka suoritettiin samoissa liuosolosuhteissa käyttäen näytteitä, jotka sisälsivät vain monomeeriproteiineja, eivät osoittaneet CC-käyriä, ja AC-käyrät sopivat hyvin yksikomponenttisen diffuusiomallin kanssa (yhtälö 4), jossa monomeeristen proteiinien diffuusiokertoimet ovat odotetut (kuva 7b). ), oikea paneeli).Aggregoituneiden hiukkasten diffuusiokerroin on alle 1 µm2/s ja monomeeristen proteiinien noin 1 µm2/s.50-100 µm/s;arvot ovat samanlaisia ​​kuin aiemmin julkaistut arvot sonikoiduille αS-amyloidifibrilleille ja monomeeriselle αS:lle erikseen samanlaisissa liuosolosuhteissa44.Kun analysoimme aggregaatteja TCCD-räjähdysanalyysillä (kuva 7c, yläpaneeli), havaitsimme, että kussakin eristetyssä aggregaatissa (αS/Tau-heteroaggregaatti) noin 60 % havaituista aggregaateista sisälsi sekä αS:n että tau:n, ja noin 30 % sisälsi vain tau, vain noin 10 % αS.αS/Tau-heteroaggregaattien stoikiometrinen analyysi osoitti, että suurin osa heteroaggregaateista rikastui tau:lla (stoikiometria alle 0,5, tau-molekyylien keskimääräinen lukumäärä aggregaattia kohti on 4 kertaa enemmän kuin αS-molekyylejä), mikä on yhdenmukainen FLIM in situ -tutkimuksessa havaitsemamme työmme kanssa. kokeiluja..FRET-analyysi osoitti, että nämä aggregaatit sisälsivät molemmat proteiinit, vaikka todellisilla FRET-arvoilla ei tässä tapauksessa ole suurta merkitystä, koska fluoroforien jakautuminen kussakin aggregaatissa oli satunnainen johtuen kokeessa käytetystä leimaamattoman proteiinin ylimäärästä.Mielenkiintoista on, että kun suoritimme saman analyysin käyttämällä 45,46-kypsää amyloidiaggregaatiopuutteellista Tau-varianttia (katso täydentävä kuva 11a, b), huomasimme, että vaikka αS:n sähköstaattinen aggregaatio oli sama (lisäkuva 11c, d), kyky muodostaa aggregaatteja koaservaatin sisällä heikkeni huomattavasti ja FLIM havaitsi useita pisteitä in situ -kokeissa, ja eristetyille kokoomanäytteille havaittiin heikkoja ristikorrelaatiokäyriä.Pienellä määrällä havaittuja aggregaatteja (vain kymmenesosa Tau441:stä) havaitsimme kuitenkin, että jokainen aggregaatti oli rikastunut αS:llä kuin tämä Tau-variantti, ja noin 50 % havaituista aggregaateista sisälsi vain αS-molekyylejä, ja αS oli ylimäärin heterogeenista. .aggregaatit (katso täydentävä kuva 11e), toisin kuin Tau441:n tuottamat heterogeeniset aggregaatit (kuvio 6f).Näiden kokeiden tulokset osoittivat, että vaikka aS itse pystyy kerääntymään taun kanssa koaservaatissa, taun nukleaatio on edullisempi näissä olosuhteissa, ja tuloksena olevat amyloidin kaltaiset aggregaatit pystyvät toimimaan aS:n ja tau:n muotoina.Kuitenkin, kun tau-rikas ydin on muodostunut, heterotyyppiset vuorovaikutukset aS:n ja taun välillä suosivat aggregaatteja tau-molekyylien välisten homotyyppisten vuorovaikutusten sijaan;havaitsemme myös proteiiniverkostoja nestemäisissä αS/tau-koaservaateissa.
aS/Tau441-sähköstaattisissa koaservaateissa muodostuneiden eristettyjen aggregaattien yksittäisistä molekyyleistä edustavat fluoresenssin temporaaliset jäljet.Purskeet, jotka vastaavat αS/Tau441-koaggregaatteja (purskeet, jotka ylittivät ilmoitetun kynnyksen) havaittiin kolmessa havainnointikanavassa (AF488- ja Atto647N-emissio suoran virityksen jälkeen, siniset ja punaiset viivat, Atto647N-emissio epäsuoran virityksen jälkeen), FRET, violetti viiva).b LLPS:stä saadun eristettyjen αS/Tau441-aggregaattien näytteen FCS/FCCS-analyysi (vasen paneeli).Autokorrelaatiokäyrät (AC) AF488:lle ja Atto647N:lle on esitetty sinisenä ja punaisena, ja ristikorrelaatio (CC) käyrät, jotka liittyvät molempia väriaineita sisältäviin aggregaatteihin, on esitetty purppuraisina.AC-käyrät heijastavat leimattujen monomeeristen ja aggregoituneiden proteiinilajien läsnäoloa, kun taas CC-käyrät osoittavat vain kaksoisleimattujen aggregaattien diffuusion.Sama analyysi, mutta samoissa liuosolosuhteissa kuin eristetyissä täplissä, näytteet, jotka sisältävät vain monomeeristä αS:ää ja Tau441:tä, näytetään kontrollina oikeanpuoleisessa paneelissa.c αS/Tau441 sähköstaattisissa koaservaateissa muodostuneiden eristettyjen aggregaattien yksittäisten molekyylien fluoresenssi-flash-analyysi.Tiedot kustakin neljästä eri toistosta löytyvästä aggregaatista (N = 152) piirretään niiden stoikiometriaa, S-arvoja ja FRET-tehokkuutta vastaan ​​(yläpaneeli, väripalkki heijastaa esiintymistä).Aggregaatteja voidaan erottaa kolmea tyyppiä: -aS-aggregaatit, joiden S~1 ja FRET~0, Tau-vain aggregaatit, joiden S~0 ja FRET~1, ja heterogeeniset Tau/αS-aggregaatit, joiden väli on S- ja FRET. Arviot määrästä kummassakin heterogeenisessä aggregaatissa havaitut markkeriproteiinit (N = 100) esitetään alemmassa paneelissa (väriasteikko heijastaa esiintymistä).Raakadata toimitetaan raakadatatiedostoina.
Nestemäisten proteiinikondensaattien kypsymisen tai vanhenemisen geelimäisiksi tai kiinteiksi rakenteiksi ajan myötä on raportoitu liittyvän useisiin kondensaatin fysiologisiin toimintoihin47 sekä sairauksiin epänormaalina prosessina, joka edeltää amyloidiaggregaatiota 7, 48, 49. tutkimme vaiheiden erottelua ja käyttäytymistä yksityiskohtaisesti.LSPT αS satunnaisten polykationien läsnä ollessa kontrolloidussa ympäristössä pienissä mikromolaarisissa pitoisuuksissa ja fysiologisesti merkityksellisissä olosuhteissa (huomaa, että laskettu αS:n fysiologinen pitoisuus on > 1 µM50) LPS:n tyypillisen termodynaamisesti ohjatun käyttäytymisen mukaisesti.Havaitsimme, että αS, joka sisältää erittäin negatiivisesti varautuneen C-terminaalisen alueen fysiologisessa pH-arvossa, pystyy muodostamaan proteiinipitoisia pisaroita vesiliuoksessa LLPS:n kautta erittäin kationisten epäjärjestettyjen peptidien, kuten pLK tai Tau, läsnä ollessa sähköstaattisen prosessin kautta. kompleksinen kondensaatio aggregoituvien makromolekyylien läsnä ollessa.Tällä prosessilla voi olla merkityksellisiä vaikutuksia soluympäristössä, jossa αS kohtaa erilaisia ​​polykationisia molekyylejä, jotka liittyvät sen sairauteen liittyvään aggregaatioon sekä in vitro että in vivo51, 52, 53, 54.
Monissa tutkimuksissa proteiinin dynamiikkaa pisaroissa on pidetty yhtenä kypsymisprosessia määrittävänä avaintekijänä55,56.Sähköstaattisissa αS-koaservaateissa polykationien kanssa kypsymisprosessi riippuu ilmeisesti polykationien kanssa tapahtuvien vuorovaikutusten voimakkuudesta, valenssista ja näiden vuorovaikutusten moninaisuudesta.Tasapainoteoria ehdottaa, että kahden nestemäisen tilan tasapainomaisema olisi suuren pisaran läsnäolo, jossa on runsaasti biopolymeerejä, jotka ohjaavat LLPS:ää57,58.Pisarakasvu voidaan saavuttaa Ostwald-kypsymisellä59, sulautumalla60 tai käyttämällä vapaata monomeeriä dispergoituneessa faasissa61.αS:lle ja Tau441:lle, ΔNt-Tau:lle tai pLK:lle suurin osa proteiinista konsentroitui kondensaatissa tässä tutkimuksessa käytetyissä olosuhteissa.Vaikka täysikokoiset tau-pisarat sulautuivat nopeasti pintaan kostuttaessa, pisaroiden yhdistäminen ja kostutus olivat vaikeita ΔNt-Tau:lle ja pLK:lle, mikä viittaa nestemäisten ominaisuuksien nopeaan menettämiseen näissä kahdessa järjestelmässä.FLIM-FRET-analyysimme mukaan vanhentuneet pLK- ja ΔNt-Tau-pisarat osoittivat samanlaista proteiinien aggregaatiota (samanlainen fluoresenssin elinikä) kuin alkuperäiset pisarat, mikä viittaa siihen, että alkuperäinen proteiiniverkko säilyi, vaikkakin jäykempi.
Rationalisoimme kokeelliset tulokset seuraavassa mallissa (Kuva 8).Aluksi tilapäisesti muodostuneet pisarat ovat usein proteiiniverkkoja ilman sähköstaattista kompensaatiota, ja näin ollen erityisesti pisaroiden rajapinnassa on varausepätasapainoalueita, mikä johtaa pisaroihin, joilla on korkea sähköstaattinen pintapotentiaali.Varauksen kompensoimiseksi (ilmiö, jota kutsutaan yleisesti valenssin ehtymiseksi) ja pisaroiden pintapotentiaalin minimoimiseksi, pisarat voivat sisältää uusia polypeptidejä laimeasta faasista, järjestää uudelleen proteiiniverkostoja varaus-varausvuorovaikutusten optimoimiseksi ja olla vuorovaikutuksessa muiden pisaroiden kanssa.pintojen kanssa (kostutus).αS/pLK-pisarat näyttävät pystyvän tasapainottamaan kondensaatin varauksen nopeammin johtuen yksinkertaisemmasta proteiiniverkostostaan ​​(vain heterotyyppiset vuorovaikutukset αS:n ja pLK:n välillä) ja suuremmasta affiniteetista proteiini-proteiini-vuorovaikutuksiin;todellakin havaitsimme nopeampaa proteiinikinetiikkaa alun perin muodostuneissa αS/pLK-koaservaateissa kuin αS/Tau:ssa.Valenssin ehtymisen jälkeen vuorovaikutukset muuttuvat vähemmän lyhytaikaisiksi ja pisarat menettävät nestemäisiä ominaisuuksiaan ja muuttuvat geelimäisiksi, syttymättömiksi pisaroiksi, joilla on alhainen sähköstaattinen pintapotentiaali (ja siksi ne eivät pysty kostuttamaan pintaa).Sitä vastoin αS/Tau-pisarat ovat vähemmän tehokkaita pisaroiden varaustasapainon optimoinnissa johtuen monimutkaisemmista proteiiniverkostoista (sekä homotyyppisistä että heterotyyppisistä vuorovaikutuksista) ja proteiinivuorovaikutusten heikommasta luonteesta.Tämä johtaa pisaroihin, jotka säilyttävät nesteen käyttäytymisen pitkiä aikoja ja joilla on korkea sähköstaattinen pintapotentiaali, joka yleensä minimoituu sulautumalla ja kasvamalla (minimoiden siten pisaroiden pinta-alan/tilavuussuhteen) ja kostuttamalla hydrofiilisen pintakemikaalin.Tämä luo suuria keskittyneitä proteiinikirjastoja, jotka säilyttävät nesteominaisuudet, koska vuorovaikutukset pysyvät hyvin ohimenevinä johtuen jatkuvasta varausoptimoinnin etsimisestä proteiiniverkossa.Mielenkiintoista on, että Taun N-terminaalisesti typistetyillä muodoilla, mukaan lukien jotkut luonnollisesti esiintyvät isoformit62, on keskimääräinen käyttäytyminen, ja jotkut koaservoivat ikääntymistä αS:n kanssa pitkäikäisiksi geelimäisiksi pisaroiksi, kun taas toiset muuttuvat suuriksi nestemäisiksi kondensaatteiksi.Tämä kaksinaisuus αS-sähköstaattisten koaservaattien kypsymisessä on yhdenmukainen viimeaikaisten LLPS:n teoreettisten ja kokeellisten tutkimusten kanssa, jotka ovat tunnistaneet korrelaation valenssin ehtymisen ja kondensaattien sähköstaattisen seulonnan välillä avaintekijänä kondensaatin koon ja nesteen ominaisuuksien säätelyssä.Mekanismi 58.61.
Tämä kaavio esittää oletetun amyloidiaggregaatioreitin aS:lle ja Tau441:lle LLPS:n ja LSPT:n kautta.Muiden anionipitoisten (punainen) ja kationirikkaiden (sinisten) alueiden ansiosta αS- ja tau-elektrostaattisilla koaservaatteilla, joilla on tyydyttävä valenssi, on pienempi pintaenergia ja siksi vähemmän yhteenliittymistä, mikä johtaa nopeaan pisaroiden ikääntymiseen.Saavutetaan stabiili agglomeroitumaton geelitila..Tämä tilanne on erittäin suotuisa αS/pLK-järjestelmän tapauksessa sen korkeamman affiniteetin ja yksinkertaisemman proteiini-parivuorovaikutusverkoston ansiosta, mikä mahdollistaa nopean geelimäisen siirtymän.Päinvastoin, pisarat, joilla on epätyydyttävä valenssi ja siten vuorovaikutukseen käytettävissä olevat proteiinivarautuneet alueet, helpottavat koaservaatin sulautumista ja kostuttamista hydrofiiliseen pintaan sen korkean pintaenergian vähentämiseksi.Tämä tilanne on parempi αS/Tau441-koaservaateille, joilla on moniarvoinen kompleksiverkko, joka koostuu heikoista Tau-Tau- ja αS-Tau-vuorovaikutuksista.Suuremmat koaservaatit puolestaan ​​säilyttävät helpommin nestemäiset ominaisuutensa, mikä mahdollistaa muiden proteiinien ja proteiinien välisten vuorovaikutusten esiintymisen.Lopulta koaservaattinesteeseen muodostuu heterogeenisiä amyloidiaggregaatteja, jotka sisältävät sekä αS:n että tau:n, mikä saattaa olla sukua inkluusiokappaleissa esiintyville aggregaateille, jotka ovat hermostoa rappeutuvien sairauksien tunnusmerkkejä.
Suuret nestemäiset rakenteet, jotka muodostuvat αS/Tau441:n kypsymisen aikana erittäin ruuhkaisen mutta dynaamisen proteiiniympäristön kanssa ja pienemmässä määrin αS/ΔNt-Tau-koaservaatit ovat ihanteellisia säiliöitä proteiinien aggregaation ytimelle.Olemme todellakin havainneet kiinteiden proteiiniaggregaattien muodostumista tämän tyyppisissä proteiinin koaservaateissa, jotka usein sisältävät sekä αS:ää että tau:a.Olemme osoittaneet, että nämä heteroaggregaatit stabiloituvat ei-elektrostaattisilla vuorovaikutuksilla, ne pystyvät sitomaan amyloidispesifisiä ThT-värejä samalla tavalla kuin tyypilliset amyloidifibrillit, ja niillä on todellakin samanlainen vastustuskyky erilaisille vaikutuksille.LLPS:n muodostamilla aS/tau-aggregaateilla osoitettiin olevan amyloidin kaltaisia ​​ominaisuuksia.Itse asiassa Taun kypsä variantti, josta puuttuu amyloidiaggregaatio, on merkittävästi heikentynyt näiden heterogeenisten αS-aggregaattien muodostumisessa nestemäisessä sähköstaattisessa koaservaatissa.αS/Tau441-aggregaattien muodostumista havaittiin vain koaservaattien sisällä, jotka säilyttivät nestemäiset ominaisuudet, eikä koskaan, jos koaservaatit/pisarat eivät saavuttaneet geelimäistä tilaa.Jälkimmäisessä tapauksessa sähköstaattisten vuorovaikutusten lisääntynyt voimakkuus ja sen seurauksena proteiiniverkoston jäykkyys estävät proteiinien välttämättömät konformationaaliset uudelleenjärjestelyt uusien proteiinivuorovaikutusten muodostamiseksi, jotka ovat välttämättömiä amyloidin nukleaatiolle.Tämä voidaan kuitenkin saavuttaa joustavammilla, nestemäisillä koaservaatteilla, jotka puolestaan ​​pysyvät todennäköisemmin nestemäisinä koon kasvaessa.
Se tosiasia, että aggregaattien muodostuminen kondensoituneessa faasissa on edullisempaa suurissa αS/Tau-kondensaateissa kuin pienissä pisaroissa, jotka geeliytyvät nopeasti, korostaa pisaroiden yhteensulautumista säätelevien tekijöiden tunnistamisen merkitystä.Näin ollen ei ole vain taipumusta faasien erottumiseen, vaan lauhteen kokoa on säädettävä asianmukaisen toiminnan ja sairauksien ehkäisemisen varmistamiseksi58,61.Tuloksemme korostavat myös LLPS:n ja LSPT:n välisen tasapainon merkitystä αS/Tau-järjestelmälle.Vaikka pisaroiden muodostuminen voi suojata amyloidiaggregaatiota vastaan ​​vähentämällä kyllästysolosuhteissa saatavilla olevien proteiinimonomeerien määrää, kuten on ehdotettu muissa järjestelmissä 63, 64, pisaroiden fuusio korkeilla pisaratasoilla voi johtaa sisäiseen proteiinien aggregaatioon hitaiden konformaatioiden uudelleenjärjestelyjen kautta.proteiiniverkostot..
Kaiken kaikkiaan tietomme korostavat voimakkaasti koheesiivisen valenssin ja tyytyväisten/tyytymättömien vuorovaikutusten merkitystä pudotusverkostoissa LSPT:n yhteydessä.Erityisesti osoitamme, että täyspitkät αS/Tau441-kondensaatit pystyvät fuusioitumaan ja ydintymään tehokkaasti muodostaen amyloidin kaltaisia ​​heteroaggregaatteja, jotka sisältävät sekä proteiineja että ehdottavat molekyylimekanismia kokeellisten tulostemme perusteella.Kahden proteiinin yhteisaggregoituminen αS/Tau-nestekoaservaatissa, jonka tässä raportoimme, voi todellakin liittyä kahden proteiinin yhteispaikaloitumiseen inkluusioissa, jotka ovat taudin tunnusmerkkejä ja voivat auttaa ymmärtämään LLPS:n ja LLPS:n välistä suhdetta. amyloidiaggregaatio, joka tasoittaa tietä erittäin varautuneelle IDP:lle hermosolujen rappeutumisessa.
Monomeeriset WT-aS-, kysteiinimutantit (Q24C-aS, N122C-aS) ja ACt-aS-variantit (A101-140) ilmennettiin E. colissa ja puhdistettiin kuten aiemmin on kuvattu.5 mM DTT sisällytettiin kaikkiin αS-kysteiinimutanttien puhdistuksen vaiheisiin disulfidisidoksen muodostumisen estämiseksi.Tau441-isoformi (plasmidi hankittu Addgene #16316:sta), ΔNt-Tau-variantti (Δ1–150, saatu kloonaamalla IVA alukkeilla CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) ja AggDEF1-2CT5-puhdistettu variantti (G3A1-2CTTa5) E. coli -viljelmät olivat kasvatettiin arvoon OD600 = 0,6-0,7 37 °C:ssa ja 180 rpm:ssä, ja ekspressio indusoitiin IPTG:llä 3 tunnin ajan 37 °C:ssa.Kerää solut 11 500 x g:ssä 15 minuutin ajan 4 °C:ssa ja pese suolaliuospuskurilla, joka sisältää 150 mM NaCl:a.Suspendoi pelletti uudelleen lyysipuskuriin (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, bentsamidiini 50 µM, 00 copeptin1M).Sonikointivaihe suoritettiin jäillä amplitudilla 80 % 10 pulssia (1 min päällä, 1 min pois).Älä ylitä 60 ml yhdellä ultraäänellä.E. coli -lysaatteja kuumennettiin 95 °C:ssa 20 minuuttia, sitten jäähdytettiin jäillä ja sentrifugoitiin 127 000 x g:ssä 40 minuuttia.Kirkastettu supernatantti asetettiin 3,5 kDa:n kalvolle (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) ja dialysoitiin 4 litraa dialyysipuskuria (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM) vastaan. PMSF 0,1 mM) 10 tunnin ajan.5 ml:n kationinvaihtokolonni (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) tasapainotettiin tasapainotuspuskurilla (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau-lysaatti suodatettiin 0,22 µm:n PVDF-suodattimen läpi ja injektoitiin pylvääseen virtausnopeudella 1 ml/min.Eluointi suoritettiin asteittain, tau eluoitiin 15-30 % eluutiopuskurilla (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla, ja kaikki fraktiot, jotka sisälsivät yhden vyöhykkeen, jolla oli odotettu taun molekyylipaino, konsentroitiin käyttämällä 10 kDa:n sentrifugisuodatinta ja korvattiin puskurilla, joka sisälsi 10 mM HEPES:ää, pH 7,4, NaCl:a 500 mM ja DTT:tä 2 mM. lopullinen proteiinipitoisuus oli 100 µM.Proteiiniliuos vietiin sitten 0,22 µm:n PVDF-suodattimen läpi, jäädytettiin nopeasti ja säilytettiin -80 °C:ssa.Proteiini K18 on ystävällisesti toimittanut prof. Alberto Boffi.Valmisteen puhtaus oli > 95 %, kuten SDS-PAGE ja MALDI-TOF/TOF vahvistivat.Erilaiset kysteiinit leimattiin kemiallisesti AlexaFluor488-maleimidillä (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) tai TEMPOL-maleimidillä (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).varmistettiin absorbanssilla ja MALDI-TOF/TOF:llä.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ja K18 leimattiin luontaisilla kysteiinitähteillä asemissa 191 ja 322 käyttämällä Atto647N-maleimidiä (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Saksa) noudattaen samaa menettelyä.Nettovaraus jäännöstä kohden αS:n ja Tau441:n kartat luotiin käyttämällä CIDER66:ta.
Kiinteä poly-L-lysiini (pLK DP 90-110 NMR:n mukaan toimittajalta Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) liuotettiin 10 mM HEPES:iin, 100 mM NaCl:iin, pH 7,4 - 10 mM, prosessi sonikoitiin 5 minuuttia ultraäänivesihauteessa ja säilytä -20°C:ssa.PEG-8, dekstraani-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) ja FITC-dekstraani-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) ovat vesiliukoisia ja niitä on laajalti levinnyt LLPS-puskurissa.Dialyysi poistaa saastuttavat suolat.Sitten ne suodatettiin ruiskusuodattimen läpi, jonka huokoskoko oli 0,22 μm, ja niiden pitoisuudet laskettiin refraktometrillä (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).LLPS-näytteet valmistettiin huoneenlämpötilassa seuraavassa järjestyksessä: puskuri ja ekstruusio sekoitettiin ja 1 mM tris(2-karboksietyyli)fosfiinia (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(etaani- 1,2-diyylidinitriili) tetraetikkahappo (EDTA, karboksyntti) ja seos, jossa on 1 % proteaasi-inhibiittoria (PMSF 100 mM, bentsimidi 1 mM, leupeptiini 5 µM).Sitten lisätään αS ja fuusioidut polykationit (vaihtoehdot pLK tai Tau).Käytä tioflaviini-T-aikasarjakokeissa (ThT, Carbosynth, Compton, UK) ThT-kokonaiskonsentraatiota puoleksi αS-pitoisuudesta.Sekoita näytteet varovasti mutta perusteellisesti varmistaaksesi, että ne ovat tasalaatuisia.Kunkin komponentin pitoisuus vaihteli kokeesta toiseen, kuten on kuvattu Tulokset-osiossa.Atsidia käytettiin pitoisuutena 0,02 % (w/v) aina kun kokeen kesto ylitti 4 tuntia.Anna seoksen tasapainottua 5 minuuttia ennen analyysiä kaikissa LLPS-näytteitä käyttävissä analyyseissä.Valonsirontaanalyysiä varten 150 ui näytteitä ladattiin sitoutumattomille 96-kuoppaisille mikrolevyille (µClear®, musta, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Itävalta) ja peitettiin liimakalvolla.LLP:itä tarkkailtiin mittaamalla absorbanssi 350 nm:ssä liuoksen keskellä CLARIOstar-levylukijalla (BMG Labtech, Ortenberg, Saksa).Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena 25 °C:ssa ja virheet laskettiin standardipoikkeamana keskiarvosta.Laimea faasi kvantifioitiin näytteen sentrifugoinnilla ja SDS-PAGE-geelianalyysillä, ja aS-fraktio laimeassa ja väkevöidyssä faasissa kvantifioitiin erilaisissa LLPS-liuoksissa.100 µl:n LLPS-näyte, joka sisälsi 1 µM AF488-leimattua αS:ää, valmistettiin sekoittamalla perusteellisesti, mitä seurasi sentrifugointi 9600 x g 30 minuutin ajan, minkä jälkeen sakka oli yleensä näkyvissä.Supernatantin ylintä 50 μl:aa käytettiin proteiinin kvantifiointiin käyttämällä SDS-PAGE-geeliä.Geelit skannattiin AF488-suodattimilla käyttäen ChemiDoc-geelikuvausjärjestelmää (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) tai värjättiin Coomassie-värillä ja visualisoitiin sopivilla suodattimilla.Tuloksena saadut vyöhykkeet analysoitiin käyttämällä ImageJ-versiota 1.53i (National Institutes of Health, USA).Kokeet suoritettiin kahtena rinnakkaisena kahdessa eri kokeessa samanlaisilla tuloksilla.
Tyypillisesti 150 μl näytteitä levitettiin sitoutumattomille 96-kuoppaisille mikrolevyille ja visualisoitiin huoneenlämmössä Leica DMI6000B käänteismikroskoopilla (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa).Pistekokeita varten käytettiin myös u-Slide Angiogenesis -levyjä (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Saksa) tai 96-kuoppaisia ​​polystyreenimikrolevyjä (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Valonlähteinä käytettiin EL6000 halogeeni- tai elohopeametallihalogenidilamppuja (vastaavasti BF/DIC- ja WF-kuvaukseen).WF-mikroskopiassa käytettiin 40-kertaista suurennusilmaobjektiivia (Leica Microsystems, Saksa) valon keskittämiseen näytteeseen ja sen keräämiseen.AF488- ja ThT-merkityille näytteille suodata viritys ja emissio standardi GFP-suodatinsarjoilla, viritys- ja emissiokaistanpäästösuodattimilla, vastaavasti 460–500 nm ja 512–542 nm kaistanpäästösuodattimilla ja 495 nm:n dikroisella peilillä.Näytteille, jotka on merkitty Atto647N:llä, käytettiin vakiosarjaa Cy5-suodattimia, joissa oli viritys- ja emissiokaistanpäästösuodattimet 628–40 nm ja 692–40 nm, ja 660 nm:n dikroinen peili.Käytä BF- ja DIC-mikroskopiassa samaa heijastuneen valon keräysobjektiivia.Kerätty valo tallennettiin Leica DFC7000 CCD-kameralla (Leica Microsystems, Saksa).Valotusaika oli 50 ms BF- ja DIC-mikroskopialla ja 20-100 ms WF-mikroskoopilla.Vertailun vuoksi kaikkien ThT-kokeiden valotusaika oli 100 ms.Ajastettuja kokeita suoritettiin pisaroiden yhteenliittymisen visualisoimiseksi, ja kuvia kerättiin 100 ms:n välein useiden minuuttien ajan.Kuva-analyysiin käytettiin ImageJ:tä (NIH, USA).Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena samanlaisilla tuloksilla.
Kolokalisaatiokokeita, FRAP- ja 3D-rekonstruktiota varten kuvat otettiin Zeiss LSM 880 käänteisellä konfokaalimikroskoopilla käyttämällä ZEN 2 blue -versiota (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Saksa).50 µl:n näytteet asetettiin µ-Slide Angiogenesis -petrimaljoille (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Saksa), käsiteltiin hydrofiilisellä polymeerillä (ibiTreat) ja kiinnitettiin 63× öljyimmersioobjektiiviin (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil). DIC:llä).Kuvat hankittiin käyttämällä 458 nm, 488 nm ja 633 nm argonlaserlinjoja, joiden resoluutio on 0,26 µm/pikseli ja valotusaika 8 µs/pikseli viritys- ja emissioilmaisuikkunoilla 470–600 nm, 493–628 nm, 493–628 nm. ja 638–755 nm käytettiin visualisoimaan ThT, AF488 ja Atto647N, vastaavasti.FRAP-kokeita varten kunkin näytteen ajastettu valokuvaus tallennettiin 1 kuva sekunnissa.Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena huoneenlämmössä samanlaisilla tuloksilla.Kaikki kuvat analysoitiin käyttämällä Zen 2 blue edition -ohjelmistoa (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Saksa).FRAP-käyrät normalisoitiin, piirrettiin ja sovitettiin kuvista erotettuihin intensiteetti/aikatietoihin käyttämällä Zen 2:ta käyttäen OriginPro 9.1:tä.Palautumiskäyrät sovitettiin monoeksponentiaaliseen malliin molekyylidiffuusion ottamiseksi huomioon ja eksponentiaalinen lisätermi ottamaan huomioon hankinnan valkaisuvaikutuksen.Sitten laskemme D:n käyttämällä nimellistä valkaisusädettä ja aiemmin määritettyä talteenoton puoliintumisaikaa, kuten Kangin et al. yhtälössä.5 35 esitetty.
αS:n yksittäiset kysteiinivariantit syntetisoitiin 4-hydroksi-2,2,6,6-tetrametyylipiperidiini-N-oksyylillä (TEMPOL) kohdissa 24 (TEMPOL-24-αS) ja 122 (TEMPOL-122-αS), vastaavasti.Spin-leimaus EPR-kokeita varten αS-pitoisuus asetettiin arvoon 100 µM ja PEG-pitoisuus oli 15 % (w/v).Eri aggregaatioolosuhteissa αS:pLK-suhde oli 1:10, kun taas aS:ΔNt-Tau- ja aS:Tau441-suhde pidettiin 1:1:ssä.Sitoutumistitrauskokeita varten ilman ahtautta, TEMPOL-122-αS pidettiin 50 μM:ssa ja polykationit titrattiin kasvavilla pitoisuuksilla valmistaen kukin olosuhde erikseen.CW-EPR-mittaukset suoritettiin Bruker ELEXSYS E580 X-band -spektrometrillä, joka oli varustettu Bruker ER4118 SPT-N1 -resonaattorilla, joka toimii mikroaaltotaajuudella (SHF) ~9,7 GHz.Lämpötila asetettiin 25 °C:seen ja sitä säädettiin nestemäisen typen kryostaatilla.Spektrit saatiin tyydyttymättömissä olosuhteissa MW teholla 4 mW, modulaatioamplitudilla 0,1 mT ja modulaatiotaajuudella 100 kHz.Spektri-intensiteetit normalisoitiin, jotta vältettäisiin erot spin-pitoisuuksissa näytteiden välillä ja mahdollinen spin-vähennys johtuen pelkistysaineiden jäännöspitoisuuksista näytteissä, jotka sisälsivät Tau441:tä tai ΔNt-Tau:ta (läsnä alkuperäisissä proteiiniliuoksissa).Annetut g:n arvot saatiin Matlab®67:ssä toteutetulla Easyspin-ohjelmistolla (v. 6.0.0-dev.34) tehdyn EPR-spektrimallinnuksen tuloksena.Aineiston mallintamiseen käytettiin yhden/kahden komponentin isotrooppisia malleja.Kaikkien signaalien normalisoinnin jälkeen jäännösarvot laskettiin vähentämällä jokainen simulaatio vastaavasta koespektristä.Sitoutumistitrausanalyysiä varten kolmannen vyöhykkeen suhteellista intensiteettiä normalisoidun EPR-spektrin toiseen vyöhykkeeseen (IIII/III) käytettiin polykationien sitoutumisen aS:ään seuraamiseen.Dissosiaatiovakion (Kd) arvioimiseksi tuloksena oleva käyrä sovitettiin likimääräiseen malliin, jossa oletettiin n identtistä ja riippumatonta sitoutumiskohtaa.
NMR-spektroskopiakokeet suoritettiin käyttämällä Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR-spektrometriä, joka oli varustettu kryokoettimella ja Z-gradientilla.Kaikki kokeet suoritettiin käyttämällä 130–207 µM αS:a ja vastaavia αS/ΔNt-Tau- ja pLK-ekvivalensseja 10 mM HEPES:ssä, 100 mM NaCl:ssa, 10 % DO:ssa, pH 7,4, ja ne suoritettiin 15 °C:ssa.LPS:n tarkkailemiseksi NMR:llä esisekoitettuihin näytteisiin lisättiin 10 % PEG:tä.Kemiallisen siirtymän häiriökäyrä (kuvio 1b) näyttää keskimääräiset 1H- ja 15N-kemialliset siirtymät.αS 2D1H-15N HSQC-spektrit määritettiin edellisen osoituksen perusteella (BMRB-merkintä #25227) ja varmistettiin tallentamalla ja analysoimalla HNCA:n, HNCO:n ja CBCAcoNH:n 3D-spektrit.13Cα- ja 13Cβ-kemialliset siirtymät laskettiin ΔNt-Tau:n tai pLK:n läsnä ollessa mahdollisten muutosten mittaamiseksi sekundaarirakenteen trendeissä verrattuna αS-kemiallisiin siirtymiin puhtaassa satunnaiskelan konformaatiossa 68 (täydentävä kuva 5c).R1ρ-nopeudet mitattiin tallentamalla hsqctretf3gpsi-kokeet (saatu Bruker-kirjastosta) viiveillä 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 ja 800 ms, ja eksponentiaaliset funktiot säädettiin huipun viiveiden mukaan eri intensiteetillä. kertaa R1ρ:n ja sen kokeellisen epävarmuuden määrittämiseksi.
Kaksiväriset aikaerotteiset fluoresenssimikroskooppikokeet suoritettiin kaupallisella aikaresoluutiolla MT200 fluoresenssikonfokaalimikroskoopilla (PicoQuant, Berliini, Saksa) aikakorreloidulla yhden fotonin laskentalaitteella (TCSPC).Laserdiodipäätä käytetään pulssilomitusherätykseen (PIE), säde kulkee yksimuotoisen aaltoputken läpi ja on viritetty lasertehon 10-100 nW 481 nm ja 637 nm laserlinjoille dikroisen peilin jälkeen mitattuna.Tämä varmistaa optimaalisen fotonien laskentanopeuden välttäen fotonien aliasoinnin, valovalkaisun ja kyllästymisen vaikutukset.μ-Slide angiogeneesipeitelasit tai -levyt (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Saksa) asetettiin suoraan upotusveteen Super Apochromat 60x NA 1.2 -linssin päälle, jossa oli korjaava kaulus (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Pääsäteen jakajana käytettiin 488/640 nm dikroista peiliä (Semrock, Lake Forest, IL, USA).Fokusoimaton säteily estetään halkaisijaltaan 50 mikronin reiällä, jonka jälkeen fokusoitu säteily jaetaan 2 havaintopolulle 50/50 säteenjakajalla.Ilmaisimen edessä käytettiin kaistanpäästösuodattimia (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 vihreälle väriaineelle (AF488) ja 690/70 punaiselle väriaineelle (Atto647N).Ilmaisimina käytettiin yksifotonisia avalanche-diodeja (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia).Sekä tiedonkeruu että analyysi suoritettiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa SymphoTime64-ohjelmistoa (PicoQuant GmbH, Berliini, Saksa).
Viisikymmentä mikrolitraa LLPS-näytteitä laitettiin μ-Slide-angiogeneesikuoppiin (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Saksa).Tuloksena olevat kuvat tarkennetaan 20 µm:iin kuopan pohjan yläpuolelle optimaalisen objektiivin työskentelyetäisyyden saavuttamiseksi riippuville pisaroille ja ~1 µm:iin lauttojen ja pisteiden kohdalla, joiden aksiaalinen resoluutio on vähintään 0,25 µm/pikseli ja viiveaika 400 µs/pikseli.Valitse tiedot käyttämällä intensiteettikynnystä, joka perustuu keskimääräiseen taustasignaalin intensiteettiin (PBG, keskiarvo + 2σ) kullekin kanavalle siten, että valitaan vain nestemäiset proteiinipisarat, lautat tai täplät suodattaen pois kaikki mahdolliset lähtökohdat hajaantuneesta faasista.Analysoidaksemme kunkin kanavan kunkin lajin (τ) elinikää (vihreä, "g" AF488:lle ja punainen, "r" Atto647N:lle), valitsimme kiinnostavat alueet (ROI), jotka sisältävät pisaroita, lauttoja tai pisteitä (lisäkuva 1). ).8b) ja johtanut ne sovittamalla niiden elinkaaren vaimeneminen (τD, τR ja τP pisaroiden, lauttojen tai pisaroiden osalta, katso lisäkuva 8c) jokaiseen kanavaan käyttämällä hännänsovitusanalyysiä ja kaksikomponenttista vaimenemismallia.Keskiarvo τ arvosta τ.ROI:t, jotka tuottivat liian vähän fotoneja monieksponentiaaliseen sovitukseen, jätettiin pois analyysistä.Käytetty raja-arvo oli <104 fotonia lautalle ja pisteille ja 103 pudotuksille.Pisaroilla on matalampi kynnys, koska on vaikea saada vaimenemiskäyriä korkeammilla intensiteettiarvoilla, koska kuvakentässä olevat pisarat ovat yleensä pienempiä ja niitä on vähemmän.ROI:t, joiden fotonimäärä ylitti fotonien kertymisrajan (asetettu arvoon > 500 counts/piksel), hylättiin myös analysointia varten.Yhdistä kiinnostavalta alueelta saatu intensiteetin vaimenemiskäyrä intensiteetillä, joka on 90 % maksimista (hieman vaimenemisen enimmäisintensiteetin jälkeen) käyttöiän alusta alkaen varmistaaksesi minimaaliset IRF-häiriöt ja säilyttäen samalla saman kaiken intensiteetin vaimenemisen aikana. asetukset Suhteellinen aikaikkuna Analysoitiin 25-50 ROI lauttojen ja täplien osalta ja 15-25 ROI putoamista varten, kuvat valittiin yli 4 toistosta, jotka on tallennettu vähintään 3 riippumattomasta kokeesta.Kaksisuuntaisia ​​t-testejä on käytetty lajien tai koaservaattijärjestelmien välisten tilastollisten erojen arvioimiseen.Elinajan (τ) pikselikohtaista analyysiä varten laskettiin kunkin kanavan käyttöiän kokonaisvaimennus kentällä ja suoritettiin 2/3-komponentin eksponentiaalisen vaimennusmallin approksimaatio.Kunkin pikselin käyttöiän vaimennus sovitettiin sitten käyttämällä aiemmin laskettuja τ-arvoja, mikä johti pseudoväriseen FLIM-sovitettuun kuvaan.Tail-fit-elinkaarialue oli sama kaikissa saman kanavan kuvissa, ja jokainen heikkeneminen tuotti tarpeeksi fotoneja luotettavan sovituksen aikaansaamiseksi.FRET-analyysiä varten pikselit valittiin soveltamalla 100 fotonin intensiteetin kynnystä, joka keskiarvoi taustasignaalin (FBG) 11 fotonin.Kunkin kanavan fluoresenssin intensiteetti korjattiin kokeellisesti määritetyillä korjauskertoimilla: 69 spektrin ylikuuluminen α oli 0,004, suora viritys β oli 0,0305, havaitsemistehokkuus γ oli 0,517.FRET-tehokkuus pikselitasolla lasketaan sitten käyttämällä seuraavaa yhtälöä:
jossa FDD on luovuttajakanavassa (vihreässä) havaittu fluoresenssin intensiteetti, FDA on akseptorikanavassa (punaisessa) havaittu fluoresenssin intensiteetti epäsuoran virityksen aikana ja FAA on akseptorikanavassa (punaisessa) havaittu fluoresenssin intensiteetti suoran virityksen alaisena ( PIIRAKKA).Fluoresenssin intensiteettipulsseja havaitaan kanavassa).
Aseta 100 µl LLPS-reaktioliuoksia, jotka sisältävät 25 µM leimaamatonta monomeerista Tau441:tä (25 µM αS:n kanssa tai ilman) LLPS-puskuriin (täydennetty kuten edellä) ei-sitoutuville 96-kuoppaisille mikrolevyille, joissa on liimakalvopäällyste ja pisaroiden muodostuminen tarkistettiin WF-mikrokopiolla. tasapainottaminen.10 min sisällä.48 tunnin huoneenlämpötilassa inkuboinnin jälkeen proteiinilauttojen ja -täplien läsnäolo varmistettiin.Poista sitten neste varovasti lauttojen yli kuopista, lisää sitten 50 1 dissosiaatiopuskuria (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ja inkuboi 10 minuuttia.Korkea suolapitoisuus varmistaa, että LLPS ei toistu jäännös-PEG:n vuoksi ja mahdolliset proteiinikokoonpanot, jotka muodostuvat vain sähköstaattisten vuorovaikutusten seurauksena, puretaan.Tämän jälkeen kuopan pohja kaavittiin varovasti pois mikropipetin kärjellä ja saatu liuos siirrettiin tyhjään havaintokuoppaan.Kun näytteitä oli inkuboitu 50 µM ThT:llä 1 tunnin ajan, eristettyjen täplien läsnäolo tarkistettiin WF-mikroskopialla.Valmista sonikoidut αS-fibrillit inkuboimalla 300 µl 70 µM αS-liuosta PBS:ssä, jonka pH on 7,4, natriumatsidissa 0,01 %, 37 °C:ssa ja 200 rpm:ssä orbitaaliravistelijassa 7 päivän ajan.Liuosta sentrifugoitiin sitten 9600 x g 30 minuuttia, pelletti suspendoitiin uudelleen PBS:ään pH 7,4 ja sonikoitiin (1 min, 50 % sykli, 80 % amplitudi Vibra-Cell VC130 sonikaattorissa, Sonics, Newton, USA) fibrillinäytteitä suhteellisen tasaisesti pienten fibrillien kokojakautuma.
FCS/FCCS-analyysi ja kahden värin yhteensattuman havaitseminen (TCCD) suoritettiin samalla aikaresoluutiolla MT200 fluoresoivalla konfokaalimikroskoopilla (Pico-Quant, Berliini, Saksa), jota käytettiin FLIM-FRET-mikroskooppikokeissa käyttäen PIE-moodia.Näiden kokeiden laserteho lisättiin arvoihin 6,0 uW (481 nm) ja 6,2 uW (637 nm).Näiden lasertehojen yhdistelmä valittiin tuottamaan samanlainen kirkkaus käytetyille fluoroforipareille samalla kun saavutettiin optimaalinen laskentanopeus ja vältetään valovalkaisu ja kyllästyminen.Sekä tiedonkeruu että analyysi suoritettiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa SymphoTime64 versiota 2.3 ohjelmistoa (PicoQuant, Berliini, Saksa).
Näytteet eristetyistä aS/Tau-aggregaateista, jotka on saatu käyttämällä LLPS:ää, laimennetaan eristyspuskuriin sopivaan monomolekyylipitoisuuteen (tyypillisesti 1:500 laimennokseen, koska aggregaatit ovat jo alhaisissa pitoisuuksissa, kun ne eristetään koaservaattinäytteistä).Näytteet levitettiin suoraan peitelasiille (Corning, USA), jotka oli esipäällystetty BSA-liuoksella pitoisuudella 1 mg/ml.
Vihreän ja punaisen kanavan PIE-smFRET-analyysissä sovellettiin alhaisempaa 25 fotonin intensiteetin kynnystä monomeeritapahtumien aiheuttamien matalan intensiteetin signaalien suodattamiseksi (huomaa, että monomeerit ovat enemmän aggregoituja näytteitä kuin eristettyjä aggregaatteja).Tämä kynnys laskettiin viidellä kertaa puhtaiden monomeerinäytteiden analysoinnista saadun monomeerisen αS:n keskimääräiseen intensiteettiin, jotta aggregaatit voidaan valita spesifisesti analysoitavaksi.PIE-käyttöpiiri yhdessä TSCPC-tiedonkeruun kanssa on mahdollistanut elinikäisen painotussuodattimen käytön, joka auttaa eliminoimaan taustan ja spektrin ylikuulumisen.Yllä olevia kynnysarvoja käyttämällä valittu häivytysvoimakkuus korjattiin käyttämällä keskimääräistä taustasignaalia, joka määritettiin vain puskuria sisältävien näytteiden esiintymisen histogrammeista intensiteetin/salin funktiona.Suuriin aggregaatteihin liittyvät purskeet vievät tyypillisesti useita peräkkäisiä säiliöitä aikajäljessä (asetettu 1 ms:ksi).Näissä tapauksissa valittiin maksimivahvuus.FRET- ja stoikiometriseen analyysiin käytettiin teoreettisesti määritettyä gammatekijää y (0,517).Spektrin ylikuuluminen ja suora viritys ovat merkityksettömiä (kokeellisesti määritettynä) käytetyllä virityslaserin teholla.FRETin tehokkuus ja stoikiometria räjähdyksessä lasketaan seuraavasti.