Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käytät selainversiota, jossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Liukusäätimet, joissa näkyy kolme artikkelia per dia.Käytä Takaisin- ja Seuraava-painikkeita liikkuaksesi diojen välillä tai diaohjaimen painikkeita lopussa.

317 Ruostumattomasta teräksestä valmistettujen kelaputkien toimittajat

Kemiallinen koostumustaulukko ruostumattomasta teräksestä

SPACA6 on siittiöiden ilmentämä pintaproteiini, joka on kriittinen sukusolujen fuusiolle nisäkkäiden seksuaalisen lisääntymisen aikana.Tästä perustavanlaatuisesta roolista huolimatta SPACA6:n erityinen tehtävä on huonosti ymmärretty.Selvitämme SPACA6:n solunulkoisen domeenin kiderakenteen 2,2 Å:n resoluutiolla paljastaen kaksidomeeniproteiinin, joka koostuu nelijuosteisesta nipusta ja Ig:n kaltaisista β-sandwichista, jotka on liitetty lähes joustavilla linkkereillä.Tämä rakenne muistuttaa IZUMO1:tä, toista sukusolufuusioon liittyvää proteiinia, mikä tekee SPACA6:sta ja IZUMO1:stä perustajajäseniä hedelmöitykseen liittyvien proteiinien superperheeseen, jota kutsutaan tässä IST-superperheeksi.IST-superperheen määrittelee rakenteellisesti sen kierretty neljän kierteen nippu ja pari disulfidisidoksesta CXXC-motiivia.Ihmisen proteomin rakenteeseen perustuva AlphaFold-haku tunnisti lisää tämän superperheen proteiinijäseniä;erityisesti monet näistä proteiineista osallistuvat sukusolujen fuusioon.SPACA6-rakenne ja sen suhde muihin IST-superperheen jäseniin tarjoavat puuttuvan lenkin tiedossamme nisäkässukusolujen fuusiosta.
Jokainen ihmiselämä alkaa kahdesta erillisestä haploidisesta sukusolusta: isän siittiöstä ja äidin munasolusta.Tämä siittiö on voittaja intensiivisessä valintaprosessissa, jonka aikana miljoonat siittiöt kulkevat naisen sukuelinten läpi, ylittävät erilaisia ​​esteitä1 ja käyvät läpi kapasitaatiota, mikä tehostaa niiden liikkuvuutta ja pintakomponenttien prosessia2,3,4.Vaikka siittiöt ja munasolu löytäisivät toisensa, prosessi ei ole vielä ohi.Oosyyttiä ympäröi kerros cumulus-soluja ja glykoproteiinieste, nimeltään zona pellucida, jonka läpi siittiöiden on kuljettava päästäkseen munasoluun.Siittiöt käyttävät pintaadheesiomolekyylien ja kalvoon liittyvien ja erittyvien entsyymien yhdistelmää voittaakseen nämä lopulliset esteet5.Nämä molekyylit ja entsyymit varastoituvat pääasiassa sisäkalvoon ja akrosomaaliseen matriisiin, ja ne havaitaan, kun siittiöiden ulkokalvo hajoaa akrosomireaktion aikana6.Viimeinen vaihe tällä intensiivisellä matkalla on siittiö-muna-fuusiotapahtuma, jossa kaksi solua yhdistävät kalvonsa yhdeksi diploidiksi organismiksi7.Vaikka tämä prosessi on uraauurtava ihmisen lisääntymisessä, tarvittavia molekyylien vuorovaikutuksia ymmärretään huonosti.
Sukusolujen hedelmöityksen lisäksi on tutkittu laajasti kahden lipidikaksoiskerroksen fuusiokemiaa.Yleensä kalvofuusio on energeettisesti epäsuotuisa prosessi, joka vaatii proteiinikatalyytin läpikäyvän rakenteellisen konformaatiomuutoksen, joka tuo kaksi kalvoa lähemmäksi toisiaan, rikkoen niiden jatkuvuuden ja aiheuttaa fuusion8,9.Nämä proteiinikatalyytit tunnetaan fusogeeneinä ja niitä on löydetty lukemattomista fuusiojärjestelmistä.Niitä tarvitaan viruksen pääsyyn isäntäsoluihin (esim. gp160 HIV-1:ssä, piikki koronaviruksissa, hemagglutiniini influenssaviruksissa). HAP2/GCS1 kasveissa, protisteissa ja niveljalkaisissa) 16,17,18,19.Ihmisen sukusolujen fusogeenejä ei ole vielä löydetty, vaikka useiden proteiinien on osoitettu olevan kriittisiä sukusolujen kiinnittymisessä ja fuusiossa.Munasolujen ekspressoitu CD9, hiiren ja ihmisen sukusolujen fuusioimiseen tarvittava transmembraaniproteiini, löydettiin ensimmäisenä 21, 22, 23.Vaikka sen tarkka tehtävä jää epäselväksi, rooli kiinnittymisessä, munan mikrovillien kiinnittymispesäkkeiden rakenne ja/tai munasolun pintaproteiinien oikea sijainti näyttävät todennäköiseltä 24,25,26.Kaksi tyypillisintä proteiinia, jotka ovat kriittisiä sukusolujen fuusiolle, ovat siittiöproteiini IZUMO127 ja munasoluproteiini JUNO28, ja niiden keskinäinen yhdistyminen on tärkeä askel sukusolujen tunnistamisessa ja adheesiossa ennen fuusiota.Urospuoliset Izumo1 knockout -hiiret ja naaraat Juno knockout -hiiret ovat täysin steriilejä, näissä malleissa siittiöt pääsevät perivitelliiniseen tilaan, mutta sukusolut eivät fuusioidu.Samoin konfluenssi väheni, kun sukusoluja käsiteltiin anti-IZUMO1- tai JUNO27,29-vasta-aineilla ihmisen in vitro -hedelmöityskokeissa.
Äskettäin on löydetty äskettäin löydetty ryhmä siittiöiden ekspressoimia proteiineja, jotka ovat fenotyyppisesti samanlaisia ​​kuin IZUMO1 ja JUNO20, 30, 31, 32, 33, 34, 35.Siittiöiden akrosomaaliseen kalvoon liittyvä proteiini 6 (SPACA6) on tunnistettu välttämättömäksi hedelmöityksessä suuressa mittakaavassa hiiren mutageneesitutkimuksessa.Siirtogeenin liittäminen Spaca6-geeniin tuottaa fuusioimattomia siittiöitä, vaikka nämä siittiöt tunkeutuvat perivitelliiniseen tilaan36.Myöhemmät hiirillä tehdyt knockout-tutkimukset vahvistivat, että Spaca6:ta tarvitaan sukusolujen fuusioon 30,32 .SPACA6 ilmentyy lähes yksinomaan kiveksissä, ja sillä on samanlainen lokalisaatiokuvio kuin IZUMO1:llä, nimittäin siittiöiden sisäkalvossa ennen akrosomireaktiota ja siirtyy sitten ekvatoriaaliselle alueelle akrosomireaktion jälkeen 30,32.Spaca6-homologit ovat olemassa monissa nisäkkäissä ja muissa eukaryooteissa30, ja sen merkitys ihmisen sukusolujen fuusiolle on osoitettu estämällä ihmisen hedelmöittymistä in vitro SPACA6-resistenssin avulla.Toisin kuin IZUMO1 ja JUNO, SPACA6:n rakenteen, vuorovaikutusten ja toiminnan yksityiskohdat jäävät epäselväksi.
Ymmärtääksemme paremmin ihmisen siittiöiden ja munasolujen fuusion taustalla olevaa perusprosessia, jonka avulla voimme tiedottaa tulevasta perhesuunnittelun ja hedelmällisyyshoidon kehityksestä, teimme SPACA6:n rakenne- ja biokemiallisia tutkimuksia.SPACA6:n solunulkoisen domeenin kiderakenteessa on nelikierteinen nippu (4HB) ja immunoglobuliinin kaltainen (Ig:n kaltainen) domeeni, jotka on yhdistetty kvasijoustavilla alueilla.Kuten aikaisemmissa tutkimuksissa ennustettiin, 7, 32, 37 SPACA6:n domeenirakenne on samanlainen kuin ihmisen IZUMO1:n, ja näillä kahdella proteiinilla on epätavallinen motiivi: 4HB, jossa on kolmion muotoinen kierukkamainen pinta ja pari disulfidiin kytkeytyvää CXXC-motiivia.Ehdotamme, että IZUMO1 ja SPACA6 määrittelevät nyt suuremman, rakenteellisesti samankaltaisen proteiinien superperheen, joka liittyy sukusolujen fuusioon.Superperheelle ainutlaatuisten ominaisuuksien avulla suoritimme perusteellisen haun AlphaFold-rakenteellisesta ihmisen proteomista ja tunnistimme tämän superperheen lisäjäseniä, mukaan lukien useita sukusolujen fuusioon ja/tai hedelmöitykseen osallistuvia jäseniä.Nyt näyttää siltä, ​​että sukusolujen fuusioon liittyy yhteinen rakenteellinen laskos ja proteiinien superperhe, ja rakenteemme tarjoaa molekyylikartan tästä tärkeästä ihmisen sukusolujen fuusiomekanismin näkökulmasta.
SPACA6 on yksivaiheinen transmembraaniproteiini, jossa on yksi N-sidottu glykaani ja kuusi oletettua disulfidisidosta (kuvat S1a ja S2).Ilmaisimme solunulkoisen domeenin ihmisen SPACA6 (jäännökset 27-246) Drosophila S2 -soluissa ja puhdistimme proteiinin käyttämällä nikkeliaffiniteettia, kationinvaihtoa ja kokosulkeutumiskromatografiaa (kuva S1b).Puhdistettu SPACA6-ektodomeeni on erittäin vakaa ja homogeeninen.Analyysi käyttäen kokoekskluusiokromatografiaa yhdistettynä monikulmaiseen valonsirontaan (SEC-MALS) paljasti yhden piikin, jonka laskettu molekyylipaino oli 26,2 ± 0,5 kDa (kuvio S1c).Tämä on yhdenmukainen SPACA6-monomeerisen ektodomeenin koon kanssa, mikä osoittaa, että oligomeroitumista ei tapahtunut puhdistuksen aikana.Lisäksi ympyrädikroismi (CD) -spektroskopia paljasti sekalaisen α/β-rakenteen, jonka sulamispiste oli 51,3 °C (kuva S1d, e).CD-spektrien dekonvoluutio paljasti 38,6 % α-kierteisiä ja 15,8 % β-juosteisia elementtejä (kuva S1d).
SPACA6-ektodomeeni kiteytettiin käyttämällä satunnaismatriisikylvötystä38, mikä johti tietosarjaan, jonka resoluutio oli 2,2 Å (taulukko 1 ja kuva S3).Lopullinen jalostettu malli koostuu tähteistä 27–246, jossa käytetään fragmenttipohjaisten molekyylisubstituutioiden ja SAD-vaiheistustietojen yhdistelmää bromidille altistuksen kanssa rakenteen määrittämiseen (taulukko 1 ja kuva S4).Kun rakenne määritettiin, kokeellisia tai AlphaFold-rakenteita ei ollut saatavilla.SPACA6-ektodomeenin mitat ovat 20 Å × 20 Å × 85 Å, se koostuu seitsemästä kierteestä ja yhdeksästä β-säikeestä, ja siinä on pitkänomainen tertiäärinen taite, joka on stabiloitu kuudella disulfidisidoksella (kuvio 1a, b).Heikko elektronitiheys Asn243-sivuketjun päässä osoittaa, että tämä jäännös on N-sidottu glykosylaatio.Rakenne koostuu kahdesta domeenista: N-terminaalisesta neljän heliksikimpun (4HB) ja C-terminaalin Ig:n kaltaisesta domeenista, jonka välissä on sarana-alue (kuvio 1c).
SPACA6:n solunulkoisen domeenin rakenne.SPACA6:n solunulkoisen domeenin nauhakaavio, ketjun väri N:stä C-päähän tummansinisestä tummanpunaiseen.Disulfidisidoksiin osallistuvat kysteiinit on korostettu magentalla.b SPACA6:n solunulkoisen domeenin topologia.Käytä samaa värimaailmaa kuin kuvassa 1a.c SPACA6:n solunulkoinen domeeni.4HB-, sarana- ja Ig-tyyppiset verkkotunnuksen kaistalekaaviot ovat väriltään oranssit, vihreät ja siniset.Tasoja ei ole piirretty mittakaavassa.
SPACA6:n 4HB-domeeni sisältää neljä pääkierrettä (heliksit 1–4), jotka on järjestetty kierteisen kierteen muotoon (kuva 2a) vuorotellen antirinnakkais- ja rinnakkaisvuorovaikutusten välillä (kuva 2b).Pieni lisäkierre (kierre 1′) asetetaan kohtisuoraan nippuun nähden muodostaen kolmion kierteillä 1 ja 2. Tämä kolmio on hieman epämuodostunut kierteittäin kierretyssä tiivisteessä kierteiden 3 ja 4 suhteellisen tiheässä tiivisteessä ( Kuva 2a).
4HB N-liitinnauhakaavio.b Ylhäältä katsottuna neljän heliksin nippu, joista jokainen on korostettu tummansinisellä N-päässä ja tummanpunaisella C-päässä.c Ylhäältä alas -spiraalipyöräkaavio 4HB:lle, jossa jokainen jäännös on esitetty ympyränä, joka on merkitty yksikirjaimalla aminohappokoodilla;vain neljä pyörän yläosassa olevaa aminohappoa on numeroitu.Ei-polaariset jäännökset ovat värjättyjä keltaisia, polaariset varaamattomat tähteet ovat värillisiä vihreiksi, positiivisesti varautuneet tähteet ovat värjätty siniseksi ja negatiivisesti varautuneet tähteet ovat värillisiä punaisiksi.d 4HB-alueen kolmion muotoiset pinnat, 4HB:t oranssina ja saranat vihreinä.Molemmissa upeissa on sauvan muotoisia disulfidisidoksia.
4HB on keskittynyt sisäiseen hydrofobiseen ytimeen, joka koostuu pääasiassa alifaattisista ja aromaattisista jäännöksistä (kuvio 2c).Ydin sisältää disulfidisidoksen Cys41:n ja Cys55:n välillä, joka yhdistää kierteet 1 ja 2 yhteen ylempään kohotettuun kolmioon (kuva 2d).Kaksi ylimääräistä disulfidisidosta muodostui Helix 1':n CXXC-motiivin ja toisen CXXC-motiivin välillä, joka löytyy β-hiusneulan kärjestä sarana-alueella (kuva 2d).Konservatiivinen arginiinitähde, jonka funktio on tuntematon (Arg37), sijaitsee onton kolmion sisällä, jonka muodostavat helikset 1', 1 ja 2. Alifaattiset hiiliatomit Cβ, Cγ ja Cδ Arg37 ovat vuorovaikutuksessa hydrofobisen ytimen kanssa, ja sen guanidiiniryhmät liikkuvat syklisesti välillä heliksit 1 'ja 1 kautta vuorovaikutuksia Thr32 rungon ja sivuketjun (kuva S5a, b).Tyr34 ulottuu onteloon jättäen kaksi pientä onkaloa, joiden kautta Arg37 voi olla vuorovaikutuksessa liuottimen kanssa.
Ig:n kaltaiset β-sandwich-domeenit ovat suuri proteiinien superperhe, joilla on yhteinen piirre, että kaksi tai useampi monijuosteinen amfipaattinen β-levy vuorovaikuttavat hydrofobisen ytimen kautta 39. SPACA6:n C-pään Ig:n kaltaisella domeenilla on sama kuvio ja koostuu kahdesta kerroksesta (kuva S6a).Arkki 1 on neljän säikeen (säikeet D, F, H ja I) β-arkki, jossa säikeet F, H ja I muodostavat anti-rinnakkaisjärjestelyn ja säikeet I ja D ovat rinnakkaisessa vuorovaikutuksessa.Taulukko 2 on pieni vastasuuntainen kaksijuosteinen beetalevy (säikeet E ja G).Sisäinen disulfidisidos havaittiin E-ketjun C-pään ja H-ketjun keskustan (Cys170-Cys226) välillä (kuva S6b).Tämä disulfidisidos on analoginen disulfidisidokselle immunoglobuliinin β-sandwich-domeenissa40,41.
Nelilankainen β-levy kiertyy koko pituudeltaan muodostaen epäsymmetrisiä reunoja, jotka eroavat muodoltaan ja sähköstaattiselta.Ohuempi reuna on tasainen hydrofobinen ympäristöpinta, joka erottuu edukseen verrattuna SPACA6:n muihin epätasaisiin ja sähköstaattisesti vaihteleviin pintoihin (kuva S6b,c).Paljastuneiden rungon karbonyyli/aminoryhmien ja polaaristen sivuketjujen halo ympäröi hydrofobista pintaa (kuva S6c).Laajempi marginaali on katettu rajatulla kierteisellä segmentillä, joka estää hydrofobisen ytimen N-pään osan ja muodostaa kolme vetysidosta F-ketjun rungon avoimen polaarisen ryhmän kanssa (kuva S6d).Tämän reunan C-pääteosa muodostaa suuren taskun, jossa on osittain paljas hydrofobinen ydin.Taskua ympäröivät positiiviset varaukset, jotka johtuvat kolmesta kaksinkertaisesta arginiinitähteestä (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ja Arg212-Arg214) ja keskushistidiinistä (His220) (kuva S6e).
Saranaalue on lyhyt segmentti helikaalisen domeenin ja Ig:n kaltaisen domeenin välillä, joka koostuu yhdestä antirinnakkaisesta kolmijuosteisesta β-kerroksesta (säikeet A, B ja C), pienestä 310 kierteestä ja useista pitkistä satunnaisista kierukkasegmenteistä.(Kuva S7).Kovalenttisten ja sähköstaattisten kontaktien verkosto sarana-alueella näyttää stabiloivan 4HB:n ja Ig:n kaltaisen domeenin välistä orientaatiota.Verkko voidaan jakaa kolmeen osaan.Ensimmäinen osa sisältää kaksi CXXC-motiivia (27CXXC30 ja 139CXXC142), jotka muodostavat disulfidisidosparin saranan β-hiusneulan ja 4HB:n 1'-kierteen välille.Toinen osa sisältää sähköstaattisia vuorovaikutuksia Ig:n kaltaisen domeenin ja saranan välillä.Glu132 saranassa muodostaa suolasillan Arg233:n kanssa Ig:n kaltaisessa domeenissa ja Arg135:n kanssa saranassa.Kolmas osa sisältää kovalenttisen sidoksen Ig:n kaltaisen domeenin ja sarana-alueen välillä.Kaksi disulfidisidosta (Cys124-Cys147 ja Cys128-Cys153) yhdistävät saranasilmukan linkkeriin, jonka stabiloivat sähköstaattiset vuorovaikutukset Gln131:n ja rungon funktionaalisen ryhmän välillä, mikä mahdollistaa pääsyn ensimmäiseen Ig:n kaltaiseen domeeniin.ketju.
SPACA6-ektodomeenin rakennetta ja 4HB:n ja Ig:n kaltaisten domeenien yksittäisiä rakenteita käytettiin rakenteellisesti samankaltaisten tietueiden etsimiseen proteiinitietokannoista 42 .Tunnistamme osumat korkeilla Dali Z -pisteillä, pienillä standardipoikkeamilla ja suurilla LALI-pisteillä (jälkimmäinen on rakenteellisesti vastaavien tähteiden lukumäärä).Vaikka ensimmäisten 10 osuman täydestä ektodomeenihausta (taulukko S1) oli hyväksyttävä Z-pisteet > 842, pelkkä 4HB:n tai Ig:n kaltaisen verkkotunnuksen haku osoitti, että suurin osa näistä osumista vastasi vain β-voileipiä.kaikkialla esiintyvä laskos, joka löytyy monista proteiineista.Kaikki kolme hakua Dalissa tuottivat vain yhden tuloksen: IZUMO1.
Pitkään on ehdotettu, että SPACA6:lla ja IZUMO1:llä on rakenteellisia yhtäläisyyksiä 7, 32, 37.Vaikka näiden kahden sukusolufuusioon liittyvän proteiinin ektodomeenit jakavat vain 21 %:n sekvenssi-identtisyyden (kuva S8a), monimutkaiset todisteet, mukaan lukien konservoitunut disulfidisidoskuvio ja ennustettu C-terminaalinen Ig:n kaltainen domeeni SPACA6:ssa, mahdollistivat varhaiset yritykset rakentaa A:n homologiamalli SPACA6-hiirestä käyttäen IZUMO1:tä mallina37.Rakenteemme vahvistaa nämä ennusteet ja osoittaa todellisen samankaltaisuuden asteen.Itse asiassa SPACA6 ja IZUMO137, 43, 44 rakenteet jakavat saman kahden alueen arkkitehtuuri (kuva S8b) samankaltaisilla 4HB- ja Ig-kaltaisilla β-sandwich-verkkotunnuksilla, joita yhdistää sarana-alue (kuva S8c).
IZUMO1:llä ja SPACA6 4HB:llä on yhteisiä eroja perinteisiin spiraalinippuihin verrattuna.Tyypillisissä 4HB:issä, kuten endosomaaliseen fuusioon 45, 46 osallistuvissa SNARE-proteiinikomplekseissa löydetyillä 4HB:illä on tasaisin välimatkoin sijoitetut kierteet, jotka säilyttävät vakion kaarevuuden keskusakselin ympärillä 47. Sitä vastoin sekä IZUMO1:n että SPACA6:n kierteiset domeenit olivat vääristyneitä, ja kaarevuus vaihteli. epätasainen pakkaus (kuva S8d).Kierre, jonka todennäköisesti aiheuttaa heliksien 1′, 1 ja 2 muodostama kolmio, säilyy IZUMO1:ssä ja SPACA6:ssa ja stabiloituu samalla CXXC-motiivilla kierteessä 1′.Kuitenkin ylimääräinen disulfidisidos, joka löytyy SPACA6:sta (Cys41 ja Cys55, jotka yhdistävät kovalenttisesti heliksejä 1 ja 2 edellä) luo terävämmän kärjen kolmion huipulle, mikä tekee SPACA6:sta kierteisemmän kuin IZUMO1 ja ontelokolmiot ovat selvempiä.Lisäksi IZUMO1:stä puuttuu Arg37, joka havaitaan tämän SPACA6:n ontelon keskellä.Sitä vastoin IZUMO1:llä on tyypillisempi alifaattisten ja aromaattisten tähteiden hydrofobinen ydin.
IZUMO1:llä on Ig:n kaltainen domeeni, joka koostuu kaksijuosteisesta ja viisijuosteisesta β-levystä43.IZUMO1:n ylimääräinen juoste korvaa SPACA6:n käämin, joka on vuorovaikutuksessa F-säikeen kanssa ja rajoittaa rungon vetysidoksia säikeessä.Mielenkiintoinen vertailukohta on näiden kahden proteiinin Ig:n kaltaisten domeenien ennustettu pintavaraus.IZUMO1-pinta on negatiivisemmin varautunut kuin SPACA6-pinta.Lisävaraus sijaitsee lähellä siittiökalvoa päin olevaa C-päätä.SPACA6:ssa samat alueet olivat neutraaleja tai positiivisesti varautuneita (kuva S8e).Esimerkiksi SPACA6:n hydrofobinen pinta (ohuemmat reunat) ja positiivisesti varautuneet kuopat (leveämmät reunat) ovat negatiivisesti varautuneita IZUMO1:ssä.
Vaikka suhde ja toissijaisen rakenteen elementit välillä IZUMO1 ja SPACA6 ovat hyvin säilyneet, rakenteellinen kohdistus Ig:n kaltaisten verkkotunnusten osoitti, että nämä kaksi aluetta eroavat niiden yleinen suuntaus suhteessa toisiinsa (kuva S9).IZUMO1:n spiraalinippu on kaareva β-sandwichin ympärille, jolloin syntyy aiemmin kuvattu "bumerangi" muoto noin 50°:n kulmassa keskiakselista.Sitä vastoin SPACA6:n kierteinen palkki kallistui noin 10° vastakkaiseen suuntaan.Erot näissä suuntauksissa johtuvat todennäköisesti eroista sarana-alueella.Primaarisella sekvenssitasolla IZUMO1:llä ja SPACA6:lla on vähän sekvenssin samankaltaisuutta saranassa, lukuun ottamatta kysteiini-, glysiini- ja asparagiinihappotähteitä.Tämän seurauksena vetysidokset ja sähköstaattiset verkot ovat täysin erilaisia.IZUMO1:n ja SPACA6:n jakaa β-levyn toissijaiset rakenneosat, vaikka IZUMO1:n ketjut ovat paljon pidempiä ja 310 heliksi (kierre 5) on ainutlaatuinen SPACA6:lle.Nämä erot johtavat erilaisiin domeeniorientaatioihin kahdelle muuten samanlaiselle proteiinille.
Dali-palvelinhakumme paljasti, että SPACA6 ja IZUMO1 ovat ainoat kaksi kokeellisesti määritettyä proteiinitietokantaan tallennettua rakennetta, joissa on tämä tietty 4HB-kertainen (taulukko S1).Viime aikoina DeepMind (Alphabet/Google) on kehittänyt AlphaFoldin, hermoverkkopohjaisen järjestelmän, joka voi ennustaa tarkasti proteiinien 3D-rakenteet primäärisekvensseistä48.Pian sen jälkeen, kun olimme ratkaisseet SPACA6-rakenteen, AlphaFold-tietokanta julkaistiin, ja se tarjoaa ennakoivia rakennemalleja, jotka kattavat 98,5 % kaikista ihmisen proteomin proteiineista48,49.Käyttämällä ratkaistua SPACA6-rakennettamme hakumallina, rakenteellinen homologia-haku mallille AlphaFold-ihmisen proteomista tunnisti ehdokkaita, joilla on mahdollisesti rakenteellisia yhtäläisyyksiä SPACA6:n ja IZUMO1:n kanssa.Ottaen huomioon AlphaFoldin uskomattoman tarkkuuden SPACA6:n ennustamisessa (kuva S10a) – erityisesti 1,1 Å rms:n ectodomain verrattuna ratkaistuun rakenteeseen (kuva S10b) – voimme olla varmoja, että tunnistetut SPACA6-osumat ovat todennäköisesti tarkkoja.
Aiemmin PSI-BLAST etsi IZUMO1-klusteria kolmen muun siittiöön liittyvän proteiinin kanssa: IZUMO2, IZUMO3 ja IZUMO450.AlphaFold ennusti, että nämä IZUMO-perheen proteiinit laskostuvat 4HB-domeeniin samalla disulfidisidoskuviolla kuin IZUMO1 (kuvat 3a ja S11), vaikka niiltä puuttuu Ig:n kaltainen domeeni.Oletetaan, että IZUMO2 ja IZUMO3 ovat yksipuolisia kalvoproteiineja, jotka ovat samanlaisia ​​kuin IZUMO1, kun taas IZUMO4 näyttää erittyvän.IZUMO 2-, 3- ja 4-proteiinien toimintoja sukusolujen fuusiossa ei ole määritetty.IZUMO3:lla tiedetään olevan rooli akrosomin biogeneesissä siittiöiden kehityksen aikana51, ja IZUMO-proteiini muodostaa kompleksin50.IZUMO-proteiinien säilyminen nisäkkäissä, matelijoissa ja sammakkoeläimissä viittaa siihen, että niiden mahdollinen toiminta on yhdenmukainen muiden tunnettujen sukusolujen fuusioon liittyvien proteiinien, kuten DCST1/2, SOF1 ja FIMP, kanssa.
Kaavio IST-superperheen verkkoaluearkkitehtuurista, jossa 4HB, sarana ja Ig:n kaltaiset domeenit on korostettu oranssilla, vihreällä ja sinisellä.IZUMO4:ssä on ainutlaatuinen C-päätealue, joka näyttää mustalta.Vahvistetut ja oletetut disulfidisidokset esitetään kiinteällä ja katkoviivalla, vastaavasti.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F9) (jaAlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F9) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) näkyvät samassa värialueella kuin paneeli A. Disulfidisidokset näkyvät magentana.TMEM95-, IZUMO2- ja IZUMO3-kalvon läpäiseviä heliksejä ei näytetä.
Toisin kuin IZUMO-proteiini, muiden SPACA-proteiinien (eli SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 ja SPACA9) uskotaan olevan rakenteellisesti erilaisia ​​kuin SPACA6 (kuva S12).Vain SPACA9:ssä on 4HB, mutta sillä ei odoteta olevan samaa rinnakkais-anti-rinnakkaisorientaatiota tai samaa disulfidisidosta kuin SPACA6:lla.Vain SPACA1:llä on samanlainen Ig:n kaltainen domeeni.AlphaFold ennustaa, että SPACA3:lla, SPACA4:llä ja SPACA5:llä on täysin erilainen rakenne kuin SPACA6:lla.Mielenkiintoista on, että SPACA4:n tiedetään myös näyttelevän roolia hedelmöityksessä, mutta enemmän kuin SPACA6:lla, sen sijaan se helpottaa siittiöiden ja munasolujen zona pellucida52:n välistä vuorovaikutusta.
AlphaFold-hakumme löysi toisen osuman hauille IZUMO1 ja SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, yksi siittiöspesifinen transmembraaniproteiini, tekee uroshiiret hedelmättömiksi poistettaessa 32,33.Siittiöillä, joista puuttui TMEM95, oli normaali morfologia, liikkuvuus ja kyky tunkeutua zona pellucidaan ja sitoutua munakalvoon, mutta ne eivät kyenneet fuusioitumaan oosyyttikalvon kanssa.Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että TMEM95 jakaa rakenteellisia yhtäläisyyksiä IZUMO133:n kanssa.Itse asiassa AlphaFold-malli vahvisti, että TMEM95 on 4HB, jolla on sama CXXC-motiivipari kuin IZUMO1:ssä ja SPACA6:ssa ja sama lisädisulfidisidos SPACA6:n heliksien 1 ja 2 välillä (kuvio 3a ja S11).Vaikka TMEM95:stä puuttuu Ig:n kaltainen domeeni, sillä on alue, jolla on samanlainen disulfidisidoskuvio kuin SPACA6- ja IZUMO1-sarana-alueilla (kuvio 3b).Tämän käsikirjoituksen julkaisuhetkellä preprint-palvelin ilmoitti TMEM95:n rakenteen vahvistaen AlphaFold53-tuloksen.TMEM95 on hyvin samanlainen kuin SPACA6 ja IZUMO1 ja on evoluutionaalisesti konservoitunut jo sammakkoeläimissä (Kuva 4 ja S13).
PSI-BLAST-haku käytti NCBI SPACA6-, IZUMO1-4-, TMEM95-, DCST1-, DCST2-, FIMP- ja SOF1-tietokantoja määrittääkseen näiden sekvenssien sijainnin elämänpuussa.Haaroituspisteiden välisiä etäisyyksiä ei näytetä mittakaavassa.
Hämmästyttävä yleinen rakenteellinen samankaltaisuus SPACA6:n ja IZUMO1:n välillä viittaa siihen, että ne ovat konservoituneen rakenteellisen superperheen perustajajäseniä, joka sisältää TMEM95- ja IZUMO 2-, 3- ja 4-proteiinit.tunnetut jäsenet: IZUMO1, SPACA6 ja TMEM95.Koska vain harvoilla jäsenillä on Ig:n kaltaisia ​​domeeneja, IST-superperheen tunnusmerkki on 4HB-domeeni, jolla on kaikille näille proteiineille yhteisiä ainutlaatuisia piirteitä: 1) Kierretty 4HB kierteillä, jotka on järjestetty anti-rinnakkais-/rinnakkaisvuorotteluun (kuva 1). 5a), 2) nipussa on kolmion muotoinen pinta, joka koostuu kahdesta kierteestä nipun sisällä ja kolmannesta pystysuorasta kierteestä (kuva avainalue (kuva 5c). CXXC-motiivin, joka löytyy tioredoksiinin kaltaisista proteiineista, tiedetään toimivan redox-sensorina 54,55,56, kun taas IST-perheen jäsenten motiivi voidaan liittää proteiinidisulfidi-isomeraaseihin, kuten ERp57 sukusolujen fuusiossa.Rooleja liittyy 57,58.
IST-superperheen jäsenet määritellään kolmella 4HB-domeenin ominaispiirteellä: neljä kierrettä vuorotellen yhdensuuntaisen ja antirinnakkaisen suunnan välillä, ba-kolmiomainen kierukkakimppupinnat ja noin CXXC-kaksoismotiivi, joka muodostuu pienten molekyylien väliin.) N-pään heliksit (oranssi) ja sarana-alueen β-hiusneula (vihreä).
Ottaen huomioon SPACA6:n ja IZUMO1:n samankaltaisuus, edellisen kykyä sitoutua IZUMO1:een tai JUNOon testattiin.Biokerrosinterferometria (BLI) on kineettinen sitoutumismenetelmä, jota on aiemmin käytetty IZUMO1:n ja JUNO:n välisen vuorovaikutuksen kvantifiointiin.Biotiinilla leimatun anturin inkuboinnin jälkeen IZUMO1:n kanssa syöttinä, jossa oli korkea JUNO-analyytin pitoisuus, havaittiin voimakas signaali (kuva S14a), joka osoittaa sitoutumisen aiheuttaman muutoksen anturin kärkeen kiinnitetyn biomateriaalin paksuudessa.Samanlaisia ​​signaaleja (eli JUNO kytkettynä anturiin syöttinä IZUMO1-analyyttiä vastaan) (kuva S14b).Signaalia ei havaittu, kun SPACA6:ta käytettiin analyytinä anturiin sidottua IZUMO1:tä tai anturiin sidottua JUNOa vastaan ​​(kuva S14a, b).Tämän signaalin puuttuminen osoittaa, että SPACA6:n solunulkoinen domeeni ei ole vuorovaikutuksessa IZUMO1:n tai JUNOn ekstrasellulaarisen domeenin kanssa.
Koska BLI-määritys perustuu syöttiproteiinin vapaiden lysiinitähteiden biotinylaatioon, tämä modifikaatio voi estää sitoutumisen, jos lysiinitähteet ovat mukana vuorovaikutuksessa.Lisäksi sitoutumisen suuntaus suhteessa anturiin voi luoda steerisiä esteitä, joten tavanomaisia ​​alasvetomäärityksiä suoritettiin myös rekombinanttisille SPACA6-, IZUMO1- ja JUNO-ektodomeeneille.Tästä huolimatta SPACA6 ei saostunut His-merkityn IZUMO1:n tai His-merkityn JUNO:n kanssa (kuva S14c, d), mikä osoittaa, ettei BLI-kokeissa havaittu vuorovaikutusta ole.Positiivisena kontrollina vahvistimme JUNOn vuorovaikutuksen leimatun His IZUMO1:n kanssa (kuvat S14e ja S15).
SPACA6:n ja IZUMO1:n rakenteellisesta samankaltaisuudesta huolimatta SPACA6:n kyvyttömyys sitoa JUNOa ei ole yllättävää.Ihmisen IZUMO1:n pinnalla on yli 20 jäännöstä, jotka ovat vuorovaikutuksessa JUNO:n kanssa, mukaan lukien jäännökset jokaiselta kolmelta alueelta (vaikka useimmat niistä sijaitsevat sarana-alueella) (kuva S14f).Näistä tähteistä vain yksi on säilynyt SPACA6:ssa (Glu70).Vaikka monet jäännössubstituutiot säilyttivät alkuperäiset biokemialliset ominaisuutensa, olennainen Arg160-tähde IZUMO1:ssä korvattiin negatiivisesti varautuneella Asp148:lla SPACA6:ssa;aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että IZUMO1:n Arg160Glu-mutaatio poistaa melkein kokonaan sitoutumisen JUNO43:een.Lisäksi ero domeenien orientaatiossa IZUMO1:n ja SPACA6:n välillä lisäsi merkittävästi SPACA6:n vastaavan alueen JUNO-sitoutumiskohdan pinta-alaa (kuva S14g).
Huolimatta tunnetusta SPACA6:n tarpeesta sukusolujen fuusiossa ja sen samankaltaisuudesta IZUMO1:n kanssa, SPACA6:lla ei näytä olevan vastaavaa JUNO-sitoutumistoimintoa.Siksi olemme pyrkineet yhdistämään rakennetietomme evoluutiobiologian tarjoamiin todisteisiin.SPACA6-homologien sekvenssien kohdistus osoittaa yhteisen rakenteen säilymisen nisäkkäiden ulkopuolella.Esimerkiksi kysteiinijäämiä on jopa kaukaa sukulaisissa sammakkoeläimissä (kuva 6a).ConSurf-palvelinta käyttämällä 66 sekvenssin useiden sekvenssien kohdistusten säilytystiedot kartoitettiin SPACA6-pintaan.Tämäntyyppinen analyysi voi osoittaa, mitkä tähteet ovat säilyneet proteiinin evoluution aikana, ja se voi osoittaa, mitkä pinta-alueet vaikuttavat toimintaan.
SPACA6-ektodomeenien sekvenssikohdistus 12 eri lajista, jotka on valmistettu käyttämällä CLUSTAL OMEGAa.ConSurf-analyysin mukaan konservatiivisimmat paikat on merkitty sinisellä.Kysteiinijäämät on korostettu punaisella.Alueen rajat ja toissijaiset rakenteen elementit näkyvät kohdistuksen yläosassa, jossa nuolet osoittavat β-säikeitä ja aallot osoittavat heliksejä.Sekvenssejä sisältävät NCBI Access Identifiers -tunnisteet ovat: ihminen (Homo sapiens, NP_001303901), mandrilli (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapusiiniapina (Cebus mimic, XP_017359366), hevonen (Equus caballus), killer (Equus caballus, 06 w0101) XP_032_034) .), lammas (Ovis aries, XP_014955560), norsu (Loxodonta africana, XP_010585293), koira (Canis lupus familyis, XP_025277208), hiiri (Mus musculus, NP_001156381) ), Platypus, 8) , 61_89 ja Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Numerointi perustuu ihmisten järjestykseen.b SPACA6-rakenteen pintaesitys, jossa 4HB ylhäällä ja Ig:n kaltainen verkkoalue alaosassa, värit perustuvat ConSurf-palvelimen suojeluarvioihin.Parhaiten säilyneet osat ovat sinisiä, kohtalaisen säilyneet osat ovat valkoisia ja vähiten säilyneet keltaisia.violetti kysteiini.Kolme korkeaa suojaustasoa osoittavaa pintalaastaria näkyvät merkinnällä merkityissä paikoissa 1, 2 ja 3. Oikeassa yläkulmassa on 4HB-sarjakuva (sama värimaailma).
SPACA6-rakenteessa on kolme erittäin konservoitunutta pinta-aluetta (kuvio 6b).Paikka 1 kattaa 4HB:n ja sarana-alueen ja sisältää kaksi konservoitunutta CXXC-disulfidisiltaa, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144-saranaverkoston (kuva S7) ja kolme konservoitunutta ulompaa aromaattista jäännöstä (Phe31, Tyr73, Phe137)).leveämpi reuna Ig:n kaltaisesta domeenista (kuva S6e), joka edustaa useita positiivisesti varautuneita jäämiä siittiön pinnalla.Mielenkiintoista on, että tämä laastari sisältää vasta-aineepitoopin, jonka on aiemmin osoitettu häiritsevän SPACA6 30:n toimintaa.Alue 3 kattaa saranan ja Ig:n kaltaisen domeenin yhden puolen;tämä alue sisältää konservoituneita proliineja (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ja ulospäin suuntautuvia polaarisia/varautuneita tähteitä.Yllättäen useimmat tähteet 4HB:n pinnalla ovat erittäin vaihtelevia (kuvio 6b), vaikka laskos on konservoitunut koko SPACA6-homologissa (kuten hydrofobisen kimppuytimen konservatiivisuus osoittaa) ja IST-superperheen ulkopuolella.
Vaikka tämä on SPACA6:n pienin alue, jolla on vähiten havaittavia toissijaisia ​​rakenneelementtejä, monet sarana-alueen jäännökset (mukaan lukien alue 3) ovat erittäin konservoituneita SPACA6-homologien joukossa, mikä saattaa viitata siihen, että kierteisen nipun ja β-sandwichin orientaatiolla on merkitystä.konservatiivina.Huolimatta laajoista vetysidoksista ja sähköstaattisista verkoista SPACA6:n ja IZUMO1:n sarana-alueella, todisteita luontaisesta joustavuudesta voidaan nähdä IZUMO137, 43, 44:n useiden sallittujen rakenteiden kohdistamisessa.Yksittäisten domeenien kohdistus meni hyvin päällekkäin, mutta domeenien suuntaus suhteessa toisiinsa vaihteli 50° - 70° keskiakselista (kuva S16).SPACA6:n konformaatiodynamiikan ymmärtämiseksi liuoksessa suoritettiin SAXS-kokeita (kuva S17a,b).SPACA6-ektodomeenin ab initio -rekonstruktio vastasi sauvakiderakennetta (kuva S18), vaikka Kratky-kaavio osoitti jonkin verran joustavuutta (kuva S17b).Tämä konformaatio eroaa IZUMO1:n kanssa, jossa sitoutumaton proteiini saa bumerangin muodon sekä hilassa että liuoksessa43.
Joustavan alueen tunnistamiseksi erityisesti SPACA6:lla suoritettiin vety-deuterium-vaihtomassaspektroskopia (H-DXMS) ja sitä verrattiin aiemmin IZUMO143:lla saatuihin tietoihin (kuvio 7a, b).SPACA6 on selvästi joustavampi kuin IZUMO1, minkä osoittaa korkeampi deuteriuminvaihto koko rakenteessa 100 000 sekunnin vaihdon jälkeen.Molemmissa rakenteissa sarana-alueen C-terminaalinen osa osoittaa suurta vaihtotasoa, mikä luultavasti sallii 4HB:n ja Ig:n kaltaisten domeenien rajoitetun pyörimisen suhteessa toisiinsa.Mielenkiintoista on, että SPACA6-saranan C-terminaalinen osa, joka koostuu 147CDLPLDCP154-tähteestä, on erittäin konservoitunut alue 3 (kuvio 6b), mikä mahdollisesti osoittaa, että toimialueiden välinen joustavuus on SPACA6:n evoluutionaalisesti konservoitunut ominaisuus.Joustavuusanalyysin mukaan CD-lämpösulatustiedot osoittivat, että SPACA6 (Tm = 51,2 °C) on vähemmän stabiili kuin IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (kuvat S1e ja S19).
a H-DXMS-kuvat SPACA6:sta ja b IZUMO1:stä.Deuteriumin vaihtoprosentti määritettiin ilmoitettuina ajankohtina.Vety-deuterium-vaihdon tasot ilmaistaan ​​värillä gradienttiasteikolla sinisestä (10 %) punaiseen (90 %).Mustat laatikot edustavat korkean vaihdon alueita.Kiderakenteessa havaitut 4HB:n, saranan ja Ig:n kaltaisen domeenin rajat on esitetty primäärisekvenssin yläpuolella.Deuteriuminvaihtotasot 10 s, 1000 s ja 100 000 s kohdalla piirrettiin nauhakaaviolle SPACA6:n ja IZUMO1:n läpinäkyvien molekyylipintojen päälle.Rakenteiden osat, joiden deuteriuminvaihtotaso on alle 50 %, on värjätty valkoisiksi.Alueet, joissa H-DXMS-vaihto on yli 50 %, on väritetty gradienttiasteikolla.
CRISPR/Cas9- ja hiiren geenipoistogeenistrategioiden käyttö on johtanut useiden siittiöiden ja munasolujen sitoutumisen ja fuusion kannalta tärkeiden tekijöiden tunnistamiseen.IZUMO1-JUNO:n ja CD9:n rakenteen hyvin karakterisoidun vuorovaikutuksen lisäksi suurin osa sukusolujen fuusioon liittyvistä proteiineista säilyy rakenteellisesti ja toiminnallisesti arvoituksellisina.SPACA6:n biofyysinen ja rakenteellinen karakterisointi on toinen osa adheesio/fuusiomolekyylipalapeliä hedelmöityksen aikana.
SPACA6 ja muut IST-superperheen jäsenet näyttävät olevan erittäin konservoituneita nisäkkäissä sekä yksittäisissä linnuissa, matelijoissa ja sammakkoeläimissä;itse asiassa uskotaan, että SPACA6:ta tarvitaan jopa seeprakalan hedelmöityksessä 59. Tämä jakautuminen on samanlainen kuin muut tunnetut sukusolujen fuusioon liittyvät proteiinit, kuten DCST134, DCST234, FIMP31 ja SOF132, mikä viittaa siihen, että nämä tekijät ovat HAP2-puutteita (myös tunnetaan nimellä GCS1) proteiineja, jotka ovat vastuussa monien protistien katalyyttisestä aktiivisuudesta., kasvit ja niveljalkaiset.Hedelmöitetyt fuusioproteiinit 60, 61. Vaikka SPACA6:n ja IZUMO1:n välillä on vahva rakenteellinen samankaltaisuus, jompaakumpaa näistä proteiineista koodaavien geenien poisto johti hedelmättömyyteen uroshiirissä, mikä osoittaa, että niiden toiminnot sukusolujen fuusiossa eivät ole päällekkäisiä..Laajemmin yksikään tunnetuista siittiöiden proteiineista, joita tarvitaan fuusion adheesiovaiheeseen, ei ole tarpeeton.
Jää avoimeksi kysymykseksi, osallistuvatko SPACA6 (ja muut IST-superperheen jäsenet) intergameettisiin risteyksiin, muodostavatko intragameettisia verkostoja rekrytoidakseen tärkeitä proteiineja fuusiopisteisiin vai toimivatko jopa vaikeasti havaittavissa olevat fusogeenit.Yhteisimmunosaostustutkimukset HEK293T-soluissa paljastivat vuorovaikutuksen täyspitkän IZUMO1:n ja SPACA632:n välillä.Rekombinanttiset ektodomeenimme eivät kuitenkaan olleet vuorovaikutuksessa in vitro, mikä viittaa siihen, että vuorovaikutukset, jotka on nähty julkaisussa Noda et ai.molemmat deletoitiin konstruktista (huomaa IZUMO1:n sytoplasminen häntä, jonka on osoitettu olevan tarpeeton hedelmöityksessä62).Vaihtoehtoisesti IZUMO1 ja/tai SPACA6 voivat vaatia spesifisiä sitoutumisympäristöjä, joita emme toista in vitro, kuten fysiologisesti spesifisiä konformaatioita tai molekyylikomplekseja, jotka sisältävät muita proteiineja (tunnetaan tai ei vielä löydetty).Vaikka IZUMO1-ektodomeenin uskotaan välittävän siittiöiden kiinnittymistä munasoluun perivitelliinitilassa, SPACA6-ektodomeenin tarkoitus on epäselvä.
SPACA6:n rakenne paljastaa useita konservoituneita pintoja, jotka voivat olla mukana proteiini-proteiini-vuorovaikutuksessa.Sarana-alueen konservoituneessa osassa, joka on välittömästi CXXC-motiivin vieressä (nimetty yllä olevaksi patch 1), on useita ulospäin suuntautuvia aromaattisia tähteitä, jotka liittyvät usein biomolekyylien välisiin hydrofobisiin ja π-pinoutuviin vuorovaikutuksiin.Ig:n kaltaisen domeenin (alue 2) leveät sivut muodostavat positiivisesti varautuneen uran, jossa on erittäin konservoituneita Arg- ja His-tähteitä, ja tätä aluetta vastaan ​​olevia vasta-aineita on aiemmin käytetty estämään sukusolujen fuusio30.Vasta-aine tunnistaa lineaarisen epitoopin 212RIRPAQLTHRGTFS225, jossa on kolme kuudesta arginiinitähteestä ja erittäin konservoitunut His220.Ei ole selvää, johtuuko toimintahäiriö näiden spesifisten jäämien tukkeutumisesta vai koko alueesta.Tämän raon sijainti lähellä β-sandwichin C-päätä osoittaa cis-vuorovaikutuksia viereisten siittiöproteiinien kanssa, mutta ei oosyyttiproteiinien kanssa.Lisäksi erittäin joustavan, runsaasti proliinia sisältävän vyön (kohta 3) pysyminen saranan sisällä voi olla proteiini-proteiinivuorovaikutuksen kohta tai, mikä todennäköisemmin, osoittaa joustavuuden säilymistä näiden kahden domeenin välillä.Sukupuoli on tärkeä SPACA6:n tuntemattomalle roolille.sukusolujen fuusio.
SPACA6:lla on solujen välisten adheesioproteiinien ominaisuuksia, mukaan lukien Ig:n kaltaiset β-sandwiches.Monilla liimaproteiineilla (esim. kadheriinit, integriinit, adhesiinit ja IZUMO1) on yksi tai useampi β-sandwich-domeeni, joka laajentaa proteiineja solukalvolta niiden ympäristökohteisiin63, 64, 65.SPACA6:n Ig:n kaltainen domeeni sisältää myös motiivin, joka löytyy yleisesti β-sandheesioista ja koheesiosta: yhdensuuntaisten säikeiden kaksoiskappaleet β-sandwich-osien päissä, jotka tunnetaan mekaanisina puristimina66.Tämän motiivin uskotaan lisäävän vastustuskykyä leikkausvoimia vastaan, mikä on arvokasta solujen välisiin vuorovaikutuksiin osallistuville proteiineille.Huolimatta tästä samankaltaisuudesta adhesiinien kanssa, tällä hetkellä ei ole näyttöä siitä, että SPACA6 olisi vuorovaikutuksessa munanvalkuaisten kanssa.SPACA6-ektodomeeni ei pysty sitoutumaan JUNOon, ja SPACA6:ta ilmentävät HEK293T-solut, kuten tässä esitetään, ovat tuskin vuorovaikutuksessa oosyyttien kanssa, joista puuttuu vyöhyke32.Jos SPACA6 muodostaa sukujen välisiä sidoksia, nämä vuorovaikutukset voivat vaatia translaation jälkeisiä modifikaatioita tai stabilointia muilla siittiöproteiineilla.Jälkimmäisen hypoteesin tueksi IZUMO1-puutteiset siittiöt sitoutuvat munasoluihin, mikä osoittaa, että muut molekyylit kuin IZUMO1 ovat mukana sukusolujen adheesiovaiheessa27.
Monilla virus-, solu- ja kehitysfuusioproteiineilla on ominaisuuksia, jotka ennustavat niiden toiminnan fusogeeneina.Esimerkiksi virusfuusioglykoproteiineilla (luokat I, II ja III) on hydrofobinen fuusiopeptidi tai -silmukka proteiinin päässä, joka liitetään isäntäkalvoon.IZUMO143:n hydrofiilisyyskartta ja IST-superperheen rakenne (määritetty ja ennustettu) eivät osoittaneet mitään ilmeistä hydrofobista fuusiopeptidiä.Siten, jos mitkään IST-superperheen proteiinit toimivat fusogeeneina, ne tekevät sen eri tavalla kuin muut tunnetut esimerkit.
Lopuksi voidaan todeta, että sukusolujen fuusioon liittyvien proteiinien IST-superperheen jäsenten toiminnot ovat edelleen kiehtova mysteeri.Luonnehdittu SPACA6-rekombinanttimolekyylimme ja sen ratkaistu rakenne antavat käsityksen näiden yhteisten rakenteiden välisistä suhteista ja niiden roolista sukusolujen kiinnittymisessä ja fuusiossa.
Ennustettua ihmisen SPACA6-ektodomeenia vastaava DNA-sekvenssi (NCBI-talletusnumero NP_001303901.1; tähteet 27–246) kodonioptimoitiin ekspressiota varten Drosophila melanogaster S2 -soluissa ja syntetisoitiin geenifragmenttina Kozakia (Eurofins Genomics) koodaavan sekvenssin kanssa., BiP-erityssignaali ja vastaavat 5'- ja 3'-päät tämän geenin ligaatiosta riippumattomaan kloonaamiseen pMT-ilmentymisvektoriin, joka perustuu metallotioneiinipromoottoriin, joka on modifioitu valintaa varten puromysiinillä (pMT-puro).pMT-puro-vektori koodaa trombiinin katkaisukohtaa, jota seuraa 10x-His C-terminaalinen merkki (kuvio S2).
SPACA6 pMT-puro -vektorin stabiili transfektio D. melanogaster S2 (Gibco) -soluihin suoritettiin samalla tavalla kuin IZUMO1:lle ja JUNO43:lle käytetty protokolla.S2-solut sulatettiin ja kasvatettiin Schneiderin elatusaineessa (Gibco), jota oli täydennetty lopullisella pitoisuudella 10 % (v/v) lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia (Gibco) ja 1X antimykoottista antibioottia (Gibco).Varhaisen siirrostuksen solut (3,0 x 106 solua) maljattiin 6-kuoppaisten levyjen (Corning) yksittäisiin kuoppiin.24 tunnin 27 °C:ssa inkuboinnin jälkeen solut transfektoitiin seoksella, jossa oli 2 mg SPACA6 pMT-puro -vektoria ja Effectene-transfektioreagenssia (Qiagen) valmistajan ohjeen mukaisesti.Transfektoituja soluja inkuboitiin 72 tuntia ja sitten kerättiin 6 mg/ml puromysiinillä.Sitten solut eristettiin täydellisestä Schneiderin alustasta ja asetettiin seerumivapaaseen Insect-XPRESS-elatusaineeseen (Lonza) suuren mittakaavan proteiinituotantoa varten.1 litran erä S2-soluviljelmää kasvatettiin 8–10 x 106 ml-1 soluiksi 2 litran tuuletetussa tasapohjaisessa polypropyleeni-Erlenmeyer-pullossa ja steriloitiin sitten lopullisella pitoisuudella 500 uM CuSO4 (Millipore Sigma) ja steriilisuodatettiin.aiheutettu.Indusoituja viljelmiä inkuboitiin 27 °C:ssa nopeudella 120 rpm neljä päivää.
SPACA6:ta sisältävä käsitelty väliaine eristettiin sentrifugoimalla nopeudella 5660 x g 4 °C:ssa, mitä seurasi Centramate tangentiaalinen virtaussuodatusjärjestelmä (Pall Corp) 10 kDa:n MWCO-kalvolla.Levitä SPACA6:ta sisältävää väkevää väliainetta 2 ml:n Ni-NTA-agaroosihartsikolonniin (Qiagen).Ni-NTA-hartsi pestiin 10 pylvään tilavuudella (CV) puskuria A ja sitten lisättiin 1 CV puskuria A, jolloin saatiin lopulliseksi imidatsolikonsentraatioksi 50 mM.SPACA6 eluoitiin 10 ml:lla puskuria A, jota oli täydennetty imidatsolilla lopulliseen pitoisuuteen 500 mM.Restriktioluokan trombiinia (Millipore Sigma) lisättiin suoraan dialyysiputkeen (MWCO 12-14 kDa) 1 yksikkö/mg SPACA6 vs. 1 I 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 ja 150 mM NaCl (puskuri B) dialyysiä varten.) 4 °C:ssa 48 tuntia.Trombiinilla pilkottu SPACA6 laimennettiin sitten kolminkertaisesti suolapitoisuuden vähentämiseksi ja ladattiin 1 ml:n MonoS 5/50 GL-kationinvaihtokolonniin (Cytiva/GE), joka oli tasapainotettu 10 mM Tris-HCl:lla, pH 7,5.Kationinvaihdin pestiin 3 OK 10 mM Tris-HCl:lla, pH 7,5, sitten SPACA6 eluoitiin lineaarisella gradientilla 0 - 500 mm NaCl 10 mm Tris-HCl:ssa, pH 7,5 25 OK:lla.Ioninvaihtokromatografian jälkeen SPACA6 konsentroitiin 1 ml:ksi ja eluoitiin isokraattisesti ENrich SEC650 10 x 300 -kolonnista (BioRad), joka oli tasapainotettu puskurilla B. Kromatogrammin mukaan SPACA6:ta sisältävät fraktiot yhdistetään ja konsentraattifraktioihin.Puhtaus säädettiin Coomassie-värjäyksellä elektroforeesilla 16 % SDS-polyakryyliamidigeelillä.Proteiinipitoisuus määritettiin absorbanssilla 280 nm:ssä käyttämällä Beer-Lambertin lakia ja teoreettista molaarista ekstinktiokerrointa.
Puhdistettua SPACA6:ta dialysoitiin yön yli 10 mM natriumfosfaattia, pH 7,4, ja 150 mM NaF:ää vastaan ​​ja laimennettiin 0,16 mg/ml:ksi ennen analyysiä CD-spektroskopialla.CD-levyjen, joiden aallonpituus on 185 - 260 nm, spektriskannaus kerättiin Jasco J-1500 spektropolarimetrillä käyttämällä kvartsikyvettejä, joiden optisen reitin pituus oli 1 mm (Helma) 25 °C:ssa nopeudella 50 nm/min.CD-spektrit korjattiin perustasolla, laskettiin keskiarvo 10 hankinnan ajalta ja muunnettiin keskimääräiseksi jäännösellipsisiksi (θMRE) asteina cm2/dmol:
jossa MW on kunkin näytteen molekyylipaino Da:na;N on aminohappojen lukumäärä;θ on elliptisyys milliasteina;d vastaa optisen polun pituutta senttimetreinä;proteiinipitoisuus yksiköissä.